《化妆品保湿功效评价体外重组3D表皮模型测试方法(T-SHRH 022—2019).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《化妆品保湿功效评价体外重组3D表皮模型测试方法(T-SHRH 022—2019).pdf（8页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 71.100.70 C2682 Y42 团团 体体 标标 准准 T/SHRH 022-2019 _ 化妆品保湿功效评价 体外重组 3D 表皮模型 测试方法 Moisturizing efficacy test of cosmetics-In vitro reconstructed human skin test method 2019-12-30 发布 2020-01-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH T/SHRH 022-2019 1 目目 次次 前言 2 1 范围 3 2.规范性引用文件 3 3.术语和定义 3 4.试验原则 3 5.试剂及仪器设备 3 6.试
2、验步骤 4 7.结果计算 5 8.结果判定 5 附录 A 资料性附录 6 附录 B 资料性附录 7 T/SHRH 022-2019 2 前前 言言 本标准按照 GB/T1.1-2009 给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准起草单位：广东博溪生物科技有限公司、上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准
3、主要起草人：李潇、李乐、张艳云、曹平、陈田、陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳、陈贞明、谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、李琼、金坚、陈亦华。T/SHRH 022-2019 3 化妆品保湿功效评价化妆品保湿功效评价 体外重组体外重组 3D 表皮模型测试方法表皮模型测试方法 1 范围范围 本标准规定了一种基于体外重组 3D 表皮模型的化妆品原料及化妆品成品的保湿功效测试方法。本标准可作为化妆品保湿功效测试替代方法之一，也可结合其他方法对化妆品保湿功效进行评价。本标准适用于具有生物学深层保湿作用的化妆品原料及成品的保湿功效测试，不适用于吸湿剂、封闭剂类化妆品。2 规规范性引用文件范性引用文件
4、下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语和定义术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。体外重组 3D 表皮模型 in vitro reconstructed human epidermis model 采用人原代表皮角质形成细胞，通过组织工程技术在体外重组的皮肤组织，具有与正常皮肤高度相似的复层化结构、生理及代谢功能。4 试试验原则验原则 4.1 本标准使用的体外重组 3D 表皮模型（EpiKutis
5、），具有表皮的复层化结构（基底层、棘层、颗粒层和角质层）和屏障功能。角质细胞内含有丰富的天然保湿因子（NMF），与皮肤保湿功能高度相关。4.2 生物学深层保湿是通过一系列的生物化学作用，提升角质细胞内天然保湿因子含量，达到提升皮肤保湿功能的作用。吡咯烷酮羧酸(Pyrrolidone Carboxylic Acid，PCA)与尿刊酸（Urocanic acid，UCA）是 NMF 的重要组成成分，通过对 PCA、UCA 的含量分析，可以评价皮肤生物学深层保湿功能。5 试剂及仪器设备试剂及仪器设备 5.1 材料及试剂材料及试剂 5.1.1 体外重组 3D 表皮模型（EpiKutis）。5.1.2
6、体外重组 3D 表皮模型培养液（EpiGrowth 培养液）。5.1.3 蛋白酶 K。5.1.4 甲酸铵。5.1.5 甲醇（色谱纯）。T/SHRH 022-2019 4 5.1.6 乙腈（色谱纯）。5.1.7 吡咯烷酮羧酸标准品（纯度 99%）。5.1.8 顺式尿刊酸标准品（Cis-UCA）（纯度 99%）。5.1.9 反式尿刊酸标准品（Trans-UCA）（纯度 99%）。5.1.10 去离子水（一级）。5.1.11 磷酸盐缓冲液（PBS）。5.2 仪器和设备仪器和设备 5.2.1 超净工作台。5.2.2 CO2培养箱：371，51%CO2，95%相对湿度。5.2.3 高效液相色谱仪。5.2
7、.4 低温高速离心机。5.2.5 氮气吹干仪。5.2.6 超声波振荡仪。5.2.7 超纯水仪。5.2.8 旋涡震荡仪。5.2.9 分析天平(精度 0.1mg)。6 试验步骤试验步骤 6.1 体外重组体外重组 3D 表皮表皮模型模型的准备的准备 该步骤在超净工作台中进行。每轮测试中，空白对照组和各待测物组均需要 1 块 6 孔板，3 个体外重组 3D 表皮模型。标记 6 孔板，在每个 6 孔板的第一排孔中各加入 0.9mL EpiGrowth 培养液。将模型转移至 6 孔板中，置于 CO2培养箱中培养（371、51%CO2、95%相对湿度）。6.2 给药给药 待测物的给药方式为模型表面给药，给药
8、量为 25L；空白对照组不进行给药处理。模型给药结束后，将 6 孔板转移至 CO2培养箱中，孵育培养 24h（37 1、5 1%CO2、95%相对湿度）。6.3 清洗清洗 模型孵育培养结束后，开始清洗程序。用无菌 PBS 溶液重复清洗模型表面 15 次，去除残留的待测物。6.4 角质层角质层 NMF 提取提取 将体外重组 3D 表皮模型用刀片沿边缘环切后，转移至 1.5mL 离心管中，并在每管中加入 500L蛋白酶 K 工作液（浓度 0.2mg/mL），置于恒温培养箱，50酶解 1h。用镊子夹取角质层，置于新的1.5mL 离心管中，并在每管中加入 250L 甲醇，超声波震荡仪震荡 30min，
9、频率 28KHz。结束后，将离心管放入低温高速离心机，4 14000rpm 离心 10min，吸取上清液，转移到新的离心管中，氮气吹干仪吹干，加入 250L 去离子水，超声波震荡 30min。超声结束后，将离心管放入低温高速离心机，4 12000rpm 离心 10min，吸取 194L 上清液到内衬管中，加入 5L 1M 甲酸铵母液及 2.5L 乙腈震荡混匀，待上机。6.5 测定条件测定条件 6.5.1 吡咯烷酮羧酸（PCA）高效液相色谱测定条件如下：a)色谱柱：C18 柱，5m，4.6*250mm。T/SHRH 022-2019 5 b）流动相：990mL 甲酸铵溶液（20mmol/L）加入
10、 10mL 乙腈，搅拌均匀，0.45m 混合过滤膜过滤，超声 15min。c）柱温：30。d）流动相流速：0.4mL/min。e）进样量：40L。f）检测波长：210nm。g）出峰时间：7.1min。6.5.2 尿刊酸（UCA）高效液相色谱测定条件如下：a)色谱柱：C18 柱，5m，4.6*250mm。b）流动相：990mL 甲酸铵溶液（20mmol/L）加入 10mL 乙腈，搅拌均匀，0.45m 混合过滤膜过滤，超声 15min。c）柱温：30。d）流动相流速：0.4mL/min。e）进样量：40L。f）检测波长：270nm。g）trans-UCA 出峰时间：9.9min cis-UCA 出
11、峰时间：15.4min。6.6 标准工作曲线绘制 按 6.5 色谱条件检测吡咯烷酮羧酸（PCA）、尿刊酸（cis-UCA、trans-UCA）标准品，并绘制标准曲线。标准品的色谱图参见附录 A，标准品的配制方法参见附录 B。6.7 测定 按色谱条件 6.5 对待测物进行测定，并根据待测物峰面积和标准曲线，计算各待测物中 PCA、cis-UCA、trans-UCA 的含量。6.8 质量控制 a)高效液相色谱仪对待测物进行定量测定时，需确认目标物的保留时间和标准品相一致。b)高效液相色谱仪检测需要设置空白试验。7 结果结果计算计算 目标物的总含量=目标物测定浓度总体积。UCA 总含量=cis-UC
12、A 含量+trans-UCA 含量。8 结果判定结果判定 以下条件说明待测物具有保湿功效:与空白对照组相比，待测物 PCA 含量显著上升，且有统计学显著性差异；与空白对照组相比，待测物 UCA 含量显著上升，且有统计学显著性差异；如待测物只满足上述部分条件，仍可说明待测物具有保湿功效。T/SHRH 022-2019 6 附 录 A（资料性附录）A.1 PCA标准品的高效液相色谱图 A.2 trans-UCA标准品的高效液相色谱图 A.3 cis-UCA标准品的高效液相色谱图 T/SHRH 022-2019 7 附 录 B（资料性附录）标准品溶液的配制及上机前预处理 1.PCA 标准品的配制 用
13、分析天平称取 PCA 标准品 16mg，放入 1.5mL 离心管中，加入 1mL 去离子水，旋涡震荡混匀，即为标准品母液（16mg/mL）。采用去离子水对母液进行 1000 倍稀释，并依次配制标准品工作液，浓度梯度分别为 16g/mL、4g/mL、1g/mL、0.25g/mL、0g/mL。2.UCA 标准品配置 2.1 trans-UCA 配制 用分析天平称取 trans-UCA 标准品 2.4mg，放入 1.5mL 离心管中，加入 1mL 去离子水，旋涡震荡混匀，即为标准品母液（2.4mg/mL）。采用去离子水对母液进行 1000 倍稀释，并依次配制标准品工作液，浓度梯度分别为 2.4g/mL、0.6g/mL、0.15g/mL、0.0375g/mL、0g/mL。2.2 cis-UCA 配制 用分析天平称取 cis-UCA 标准品 0.5mg，放入 1.5mL 离心管中，加入 1mL 去离子水，旋涡震荡混匀，即为标准品母液（0.5mg/mL）。采用去离子水对母液进行 1000 倍稀释，并依次配制标准品工作液，浓度梯度分别为 0.5g/mL、0.125g/mL、0.03g/mL、0.0075g/mL、0g/mL。2.3.上机前预处理 吸取 388L 各标准品工作液，至对应标号的进样瓶中，并向每瓶中依次补加 10L 的甲酸铵母液（1M）和 5L 的乙腈，旋涡混匀，等待上机。_