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1、第第3636讲讲基因工程基因工程实验实验实验原理：提取DNA的原理鉴定DNA的原理在一定温度下，在一定温度下，DNADNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。遇二苯胺试剂会呈现蓝色。DNA的粗提取与鉴定利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNADNA在酒精溶液中的溶解性：在酒精溶液中的溶解性：DNADNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。DNADNA在在NaClNaCl溶液中的溶解性：溶液中的溶解性：DNADNA在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液中的溶解度不同，溶液中的溶解度不同，它能溶于它能溶于2mol/L2
2、mol/L的的NaClNaCl溶液。溶液。DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。选材：注意：试剂：研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L 的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水含有NaCl、EDTA、SDS、Tris-HCl析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用可用家用洗洁精或质量百分比为10%的洗衣粉水溶液替代研磨液研磨液成分研磨液成分作用作用SDS使蛋白质变性使蛋白质变性EDTA抑制抑制DNA酶酶Tris-HCl缓冲液稳定稳定DNADNA的粗提取与鉴定取材、研磨:称取30
3、g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。研磨的目的破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中DNA的粗提取与鉴定过滤或离心取上清液：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？可能含有核蛋白、多糖等杂质低温放置几分钟的作用 可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；方案一方案一在漏斗中垫上在漏斗中垫上纱布纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 4 冰箱中放置几冰箱中放置几分钟后，再取分钟后，再取上清液上清液方案二方案二直接将研磨液倒入塑料离心管中，在直接将研磨液倒入塑
4、料离心管中，在1 500 r/min1 500 r/min的转速下离心的转速下离心5 min5 min，再取再取上清液上清液可以用可以用滤纸替代替代纱布布吗？不可以，因不可以，因为DNA会被吸附会被吸附到到滤纸上而大量上而大量损失。失。DNA的粗提取与鉴定预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA (1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向的目的是？减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子(2)酒精预冷的作用:同“低温放置的作用”方案一方案一在上清液中加入在上清液中加入体积相等的体积相等的、预冷的预冷的酒精溶液酒精溶液(体积分数为体积分数为95%)95%)，静置静置2 23 min3 min，溶液中出
5、现的白色丝状物就是粗提取的，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNADNA；用玻；用玻璃棒璃棒沿一个方向沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分方案二方案二将溶液倒入塑料离心管中，在将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min10000 r/min的转速下离心的转速下离心5 min5 min，弃，弃上清液，将管底的上清液，将管底的沉淀物沉淀物(粗提取的粗提取的DNA)DNA)晾干晾干DNA的粗提取与鉴定NaCl溶液溶解DNA并鉴定 加丝状物或沉淀物加4mL的二苯胺二苯胺试剂溶液逐渐变蓝DNA的粗提取与鉴定1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？
6、用二苯胺试剂鉴定的结果如何？观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。不同的实验材料；提取DNA的方法；2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。DNA的粗提取与鉴定1.实验原理利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理PCR利用了DNA的_原理，通过_来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_的
7、仪器，一次PCR一般要经历_次循环；热变性调节温度自动调控温度30PCR扩增DNA片段还利用了_的原理；DNA半保留复制DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有_，在一定的_下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_的作用下，这些_会向着_的电极移动，这个过程就是_；可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反PCR的产物一般通过_来鉴定；在凝胶中DNA分子的迁移速率与_、_和_等有关凝胶中的DNA分子通过_，可以在波长为_的_下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理2.材料用具PCR仪（自动
8、控温，实现DNA的扩增）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）DNA片段的扩增及电泳鉴定10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5L20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1L20mol/L的引物2.5L20mol/L的引物2.5LH2O2833L1-5U/L的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）12U模板DNA（用量为1pg-1g）510L总体积50LPCR反应体系的配方4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓
9、冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等DNA片段的扩增及电泳鉴定 使使DNADNA充分变性，以利于引物充分变性，以利于引物更好地和模板结合。更好地和模板结合。3.方法步骤（1）DNA片段的扩增移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94,5min/30次94,30s55,30s
10、 72,1min最后一次94,1min55,30s 72,1min预变性：DNA片段的扩增及电泳鉴定（2）DNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。3.方法步骤DNA片段的扩增及电泳鉴定加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内
11、含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相（2）DNA片段的电泳鉴定3.方法步骤DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的扩增及电泳鉴定为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。在进行操作时，一定要戴好一次性手套。PCR扩增不能随意加大试剂用量。3.方法步骤DNA片段的扩增及电泳鉴定1.本实验可选用新鲜的猪血作实验材料。()2.为取得较好的提取效果,实验时应离心2次,第一次离心后应保留上清液,第二次离心后应弃去上清液,且两次离心的转速也不相同。()3.二苯胺试剂要现配现用,否则二苯胺会变成浅蓝色,影响鉴定效果。()1.PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。()2.电泳鉴定PCR产物时,应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。()