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1、分子生物学基础分子生物学基础第七章真核基因表达的调控第七章真核基因表达的调控 第一节概述 一、真核基因表达调控的特点一、真核基因表达调控的特点 真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在很大的差异，主要表现在以下几个方面。在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。真核细胞中存在着一部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列，它们在整个基因组中重复几百次甚至上百万次，高等真核细胞DNA中很大一部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。第
2、一节概述 真核生物能够根据生长发育阶段的需要进行DNA片段的有序重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的的拷贝数，这种能力在原核生物中是极为罕见的。原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节点上后可直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合。而在真核生物中，基因转录的调节区则大得多，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对。虽然这些调控区也能与蛋白质结合，但是并不直接影响启动子区对RNA聚合酶的接受程度。这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译
3、成蛋白质，而原核生物中不存在这样严格的空间间隔。许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质。第一节概述 二、真核生物基因结构与转录活性二、真核生物基因结构与转录活性 1简单多基因家族 2复杂多基因家族 3发育调控的复杂多基因家族 第二节真核基因表达第二节真核基因表达DNADNA水平的调控水平的调控 一、基因丢失一、基因丢失 在有些细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而除去这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫受精卵有2条染色体，当个体
4、发育到一定阶段，分化为体细胞的那些细胞中的染色体断裂为小的片段，有着丝点的小片段保留下来，其它的不能分配到下一代而失去，基因的丢失决定了细胞的寿命。但在高等生物的细胞分化中尚未发现基因丢失现象。许多生物体分化的细胞其细胞核内保存了个体发育所必需的全部基因，这些细胞具有经去分化和再分化而发育成完整个体的潜在能力，这种能力称为全能性。第二节真核基因表达第二节真核基因表达DNADNA水平的调控水平的调控 二、基因扩增二、基因扩增 基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。基因扩增使细胞在短期内产生大量的基因产物，以满足生长发育的需要，基因扩增是基因活性调控的一种该式。最早发现的是蛙的成熟卵细
5、胞在受精后的发育过程中其rRNA基因（可称为rRNA）可扩增2000倍，以后发现其它动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂，要合成大量蛋白质需要大量核糖体。第二节真核基因表达第二节真核基因表达DNADNA水平的调控水平的调控 三、基因重排三、基因重排 第二节真核基因表达第二节真核基因表达DNADNA水平的调控水平的调控 交配型转换首先是核酸内切酶HO在MAT基因内部一个24bp序列处切开双链DNA，自由的3末端又在DNA聚合酶的作用下以上游（或下游）HML基因为模板合成双链DNA，直到完全置换所有的MATa基因，完成性别转换，如图7-2所示。图7-2酵母中的交配型转换 第
6、三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 一、真核基因转录与染色质结构变化的关系一、真核基因转录与染色质结构变化的关系 DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构影响转录，至少有以下现象：1染色质结构影响基因转录 在真核细胞中以核小体为基本单位的染色质是真核基因组DNA的主要存在方式。DNA盘绕组蛋白核心形成核小体，妨碍了与转录因子及RNA聚合酶的靠近和结合，使基因的活性受到抑制。2组蛋白的作用 组蛋白H1及核心组蛋白共同参与核小体的组装与凝聚。在特殊氨基酸残基上的乙酰化、甲基化或磷酸化等修饰，可改变蛋白质分子表面的电荷，影响核小体的结构，从而调节基因
7、的活性。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 3DNA拓扑结构变化 天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；而负性超螺旋则有利于核小体的再生成。4转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加 染色质DNA受DNase作用通常会被降解成400bp左右的片段，反映了完整的核小体规则的重复结构。但活跃进行转录的染色质受DNase消化常出现100200bp的DNA片段，且长短不均一，说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNas
8、e高敏感点。5DNA碱基修饰变化 真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5-甲基胞嘧啶(m5C)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5侧区的CpG序列中，实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 二、顺式作用元件二、顺式作用元件 顺式元件是指与参与转录调控的反式作用因子（蛋白质）相互作用的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括启动子、增强子；起负性调控作用的元件沉寂子。1启动子 与原核启动子的含义相同，是指R
9、NA聚合酶结合并起动转录的DNA序列，但真核不同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用，不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也完全不同，因而不同启动子序列也很不相同，要比原核更复杂、序列也更长。真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长730bp。它是RNA聚合酶进行精确而有效的转录所必需的。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 启动子中的元件可以分为两种。（1）核心启
10、动子元件指RNA聚合酶II起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游-45-30bp处的TATA盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。TATA盒是控制转录精确性的序列。（2）上游启动子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，就使得不同的基因表达分别有不同的调控。上游控制元件控制着转录起始的频率，启动子的强度就决定于上游启动子的数目和种类。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 2增
11、强子 增强子是指能使基因转录频率明显增加的DNA序列。增强子的作用有以下特点。增强效应十分明显。一般能使基因转录频率增加10200倍，有的可以增加上千倍，增强效应与其位置和取向无关。大多为重复序列。增强效应有严密的组织和细胞特异性。说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能。没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应。许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。增强子要有启动子才能发挥作用。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 三、反式作用因子三、反式作用因子 反式作用因子是指能直接或间
12、接与DNA上表达调控元件结合而发挥作用的蛋白质因子，常被称为转录调节因子或转录因子。反式作用因子有数百种之多，包括激活因子和阻遏因子等，它们与顺式作用元件中的上游激活序列、特异性结构，对真核生物基因的转录分别起促进和阻遏作用。反式作用因子是与顺式元件相互作用的调控转录的转录因子。反式作用因子有三个结构域，即DNA结合结构域、转录激活结构域和二聚化结构域。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 螺旋-转角-螺旋结构域是最早发现于原核生物中的一个关键因子，该结构域长约20个aa，主要是两个-螺旋区和将其隔开的转角。其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与DNA
13、序列相识别的氨基酸。其结构如图7-3所示。图7-3螺旋-转角-螺旋结构及其与DNA的结合 第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 2锌指结构域 这类结构主要见于真核生物的调节因子。其结构如图7-4所示，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。图7-4蛋白质的锌指结构 第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 3亮氨酸拉链 亮氨酸拉链最初是通过比较酵母转录激活因子GCN4、哺乳动物转录因子C/EBP（CAAT区及SV40增强子核心序列结合蛋白）以及癌基因产物Fos、Jun和Myc
14、的AA序列时发现的。亮氨酸拉链中螺旋的突出特点是每隔7个AA残基出现一个疏水的亮氨酸残基。这些残基位于DNA结合域的C端-螺旋上，这样-螺旋的侧面每两圈就会出现一个亮氨酸，形成一个疏水的表面。结果-螺旋的疏水表面间就可相互使用，形成二聚体结构。早期的研究认为两个-螺旋疏水的亮氨酸残基交错排列，故称为亮氨酸拉链 第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 4螺旋-环-螺旋结构域（HLH）螺旋-环-螺旋结合域总体上与亮氨酸拉链相似，只是它的二个-螺旋被一个螺旋的多肽分成二个单体蛋白，C端-螺旋一侧的疏水残基可以二聚化。与亮氨酸拉链一样，螺旋环螺旋结构与经常与碱性结构域相邻，以
15、形成DNA结合蛋白所需的二聚体。这种特异型二聚体的形成增加了转录因子所有组成成分的多样性和复杂性。其主要特点是可形成两个亲脂性-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。其结构如图7-6所示。第三节真核基因表达转录水平的调控第三节真核基因表达转录水平的调控 图7-6碱性螺旋-环-螺旋结构图 第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 一、转录后水平的调控一、转录后水平的调控 1rRNA和tRNA的加工成熟 rRNA加工包括分子内的切割和化学修饰两方面内容。真核生物的rRNA基因转录时先产生一个45 S的前体rRNA，然后被
16、核酸酶逐渐降解，形成成熟的18S、28S和5.8S rRNA。rRNA基因转录主要在细胞核内进行，初级转录产物45S前体rRNA很快被加工降解，生成不同相对分子质量的成熟rRNA。rRNA的化学修饰主要是甲基化，原核生物rRNA主要是碱基甲基化，而真核生物rRNA主要是核糖甲基化。tRNA基因转录时也可能首先生成前体tRNA，然后再进行加工成熟。一般认为，tRNA基因的初级转录产物在进入细胞质后，首先经过核苷的修饰，生成4.5S前体tRNA，再行剪接成为成熟tRNA（4S）。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 2mRNA的加工成熟 编码蛋白质的基因转录产生mR
17、NA。这类基因产物在转录后经过一系列的加工成为成熟的有生物功能的mRNA。这些加工主要包括：在mRNA的5末端加“帽子”，在mRNA的3末端加上poly(A)，进行RNA的剪接以及核苷酸的甲基化修饰等。由于mRNA的这些结构与它作为蛋白质合成模板的功能有密切关系，所以是基因表达的重要调控环节。与rRNA、tRNA相同，编码蛋白质的基因转录时首先生成核不均一RNA，然后再加工剪接为成熟mRNA。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 3真核生物基因转录后加工的多样性 （1）简单转录单位这类基因只编码产生一个多肽，其原始转录产物有时需要加工，有时不需加工。这类基因转录
18、后加工有3种不同形式，如图7-7所示。图7-7真核生物基因转录后加工的三种主要形式 第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 （2）复杂转录单位含有复杂转录单位的主要是一些编码组强和发育特异性蛋白质的基因，它们除了含有数量不等的内含子外，其原始转录产物能通过不同方式加工成两个或两个以上的mRNA。主要有：利用多个5端转录起始位点或剪接位点产生不同的蛋白质；利用多个加poly(A)位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质；虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点的基因。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 二、翻译水平的调控二、
19、翻译水平的调控 1可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始的调控 2mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成的起始 3mRNA5末端帽子结构的识别与蛋白质合成 （1）帽子的类型与功能真核生物mRNA5末端可能有三种不同的帽子，即O型、I型、II型，其主要差异在于帽子中碱基甲基化程度的不同。表7-3列举了这三种不同类型帽子的结构。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 （2）帽子结合蛋白（CBP）在哺乳动物细胞和部分纯化的生长因子eIF-3及eIF-4B中，找到了一个相对分子质量为2.4104、对帽子专一的多肽，称为帽子结合蛋白质I（CBPI）。高度纯化的CBPI可以促进有帽子mR
20、NA的翻译，但对不戴帽子的mRNA无效。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 4、mRNA稳定性的调节 虽然对mRNA稳定性的调节机理尚不清楚，但细胞确实可以调节各种不同mRNA的寿命。例如，蚕蛹羽化成蛾后，需要合成大量的蛋白水解酶溶解蚕丝蛋白，此时蚕丝水解酶mRNA的半衰期长达100h，而其它的mRNA的半衰期只有2.5h；催乳激素可使乳腺组织中酪蛋白mRNA的半衰期提高20倍；冬眠的种子中，各种mRNA早已存在，但它们只有在种子萌发时才被翻译；蛙卵中存在各种mRNA，但有些只在孵化前被翻译，有些只在孵化后翻译；在红细胞分化过程中，细胞可专一性降解其它mRNA
21、，而保留珠蛋白mRNA 第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 三、翻译后水平的调控三、翻译后水平的调控 1多肽的切割 多肽的切割主要包括两个方面：一是与蛋白质分泌有关的切割；二是与蛋白质活化有关的切割。（1）信号肽的切割 蛋白质的合成是在核糖体中进行的，核糖体根据DNA转录的mRNA翻译成各种蛋白质。信号肽能引导多肽链到不同的转送系统。在真核细胞中，某一多肽的N端刚合成不久，这种多肽合成后的去向就已被决定。一部分核糖体以游离状态停留在胞浆中，它们只合成供装配线粒体及叶绿体膜的蛋白质。另一部分核糖体，受新合成多肽N端的信号肽控制而进入内质网，使原来表面平滑的内质网
22、变成有局部凸起的粗面内质网。与内质网相结合的核糖体主要合成三类蛋白质：溶酶体蛋白、分泌到胞外的蛋白和构成质膜骨架的蛋白。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 信号肽在结构上具有以下特点。信号肽的氨基端至少有一个带正电荷的氨基酸，为一亲水区段。不同信号肽的亲水区段所含氨基酸残基的多少不同，从而造成信号肽长短不齐，但其长度通常为17个AA。信号肽的中部有1015个氨基酸，是由高度疏水性的氨基酸组成的肽链。信号肽的C末端有一个可被信号肽酶识别的位点，此位点上游的第一个（-1）及第三个（-3）氨基酸常为具有一个小侧链的氨基酸（如丙氨酸）。信号肽无同等性及专一性。各种分泌
23、蛋白质后的信号肽在顺序上并未发现有同等性，也未发现信号肽存在于已完成的多肽上。信号肽也无严格的专一性，表现在信号肽对所输送蛋白质结构的要求不严格，第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 （2）导肽的切割通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后进行转运的，这些蛋白质在转运之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸的一段前导肽共同组成。导肽具有下列特点。含有丰富的带正电荷的氨基酸（特别是精氨酸和赖氨酸），它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间，如果带正电荷的氨基酸被不带电荷的氨基酸代替，就不能起牵引作用。缺少或不含有带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸，特别是丝氨酸和苏氨酸的
24、含量也较丰富。有两性分子的性质（既有亲水部分，又有疏水部分），能形成两性分子的螺旋结构，使导肽能加强与生物膜或人工膜的直接相互作用；导肽的不同区段作用不同。第四节真核基因表达其他水平上的调控第四节真核基因表达其他水平上的调控 2多肽的剪接和化学修饰 （1）多肽的剪切初生蛋白质接受切割、有限水解或化学修饰而成为有活性的成熟蛋白质，这就是蛋白质活化的主要机制。近年来，不少科学家还发现，蛋白质前体可以通过多肽的剪辑被切成数个片段，然后再以一定的顺序结合起来，最后形成成熟的有活性的蛋白质。（2）多肽的化学修饰蛋白质磷酸化。蛋白激酶能将ATP末端的磷酸基团分别转移到多肽中的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上，从而使蛋白质发生磷酸化。磷酸化是蛋白质合成后广泛存在的一种化学修饰，是控制酶活性的重要步骤。蛋白质糖基化。许多重要的细胞表面蛋白、识别蛋白和分泌蛋白均带有一个或数个糖基，这类蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。这些附加的糖基有不少重要的生理功能。首先，糖基化蛋白的构型常常会发生变化，有利于抵御蛋白酶的降解反应；其次，糖蛋白上的羟基会大大提高该多肽的可溶性；第三，糖基化以后往往能使蛋白准确地进入各自的细胞器。