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1、升博生物升博生物 专业服务专业服务PCRPCR常见问题分析常见问题分析及解决方案及解决方案重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司SHENGBO BIOTECH CO.,LTD.SHENGBO BIOTECH CO.,LTD.S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司反应体系对反应体系对PCR扩增的影响扩增的影响pDNADNA模板模板纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应完整性完整性
2、模板降解会导致PCR扩增无产物浓度浓度 浓度适当p 引物引物 设计设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量合成质量 浓度浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmolS b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司反应体系对反应体系对PCR扩增的影响扩
3、增的影响p反应BufferBufferpH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境pMg 2浓度过高非特异性严重过低无扩增产物ppdNTP MixturedNTP Mixture浓度适当，避免反复冻融pddH2OpH值适当，避免污染p反应BufferBufferpH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境pMg 2浓度过高非特异性严重过低无扩增产物ppdNTP MixturedNTP Mixture浓度适当，避免反复冻融pddH2OpH值适当，避免污染p反应BufferBufferpH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境pMg 2浓度过高非特异性严重过低无扩增产物ppdNTP MixturedNTP
4、Mixture浓度适当，避免反复冻融pddH2OpH值适当，避免污染S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司如何选择最合适的如何选择最合适的DNADNA聚合酶聚合酶pPCR用耐热用耐热DNA聚合酶聚合酶（PCR 实验的不同需求）实验的不同需求）1 Taq酶酶2 pfu酶酶3 Hotstart Taq酶酶Taq plusLong TaqTaq platinum4 混合酶混合酶S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m
5、 m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司4 混合酶混合酶高扩增效率高保真度高扩增效率高保真度pTaq plusTaq+pfu用于复杂模板用于复杂模板（GC rich,二级结构）二级结构）扩增扩增大多数情况下可替代大多数情况下可替代Taq,特别是产物在特别是产物在6Kb以上时，以上时，可扩可扩10-20kb。pLong TaqTaq+pfu超长片断扩增，超长片断扩增，15-40kb.pTaq platinumHotStart+pfu高扩增效率高保真度高扩增效率高保真度S b i oS b i o.t m m u.
6、c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司预配的预配的PCRPCR反应液反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 PCR MasterMixPCR MasterMix升博生物升博生物 专业服务专业服务PCR常见问题分析常见问题分析S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司PCRPCR常见问题常见问题p无扩增产物p非特异性扩增
7、或拖尾p假阳性S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司问题问题1 1：无：无扩增产物扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品样品A 样品样品B 正对照正对照S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司1.1.纯度：含有抑制物纯度：含有抑制物2.2.浓度：含量低浓度：含量低3.3.质量：全长质
8、量：全长4.4.结构：二级结构结构：二级结构 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用优质纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板试剂盒提取模板DNADNA2.2.加大模板的用量加大模板的用量3.3.用好的反转录酶用好的反转录酶4.4.用温度高的反转录酶用温度高的反转录酶无无扩增产物之模板原因扩增产物之模板原因S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司1.引物错误引物错误2.引物设计不好引物设计不好3.引物降解引物降解4.引物合成、纯化不好引物合成、
9、纯化不好 原原因因对对策策1.1.合成前检查合成前检查2.2.评价、重新设计引物评价、重新设计引物3.3.换一管新引物换一管新引物4.4.免费重新合成免费重新合成无无扩增产物之引物原因扩增产物之引物原因S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司1.退火温度退火温度2.延伸时间延伸时间3.循环次数循环次数 原原因因对对策策1.1.递度递度PCRPCR2.2.聚合酶的延伸速度聚合酶的延伸速度3.3.适当增加循环数适当增加循环数无无扩增产物之扩增产物
10、之PCRPCR条件原因条件原因S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题问题2 2：非特异性扩增：非特异性扩增 M 1 2S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.
11、3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增非特异性扩增升博生物升博生物 专业服务专业服务提高提高PCR特异性的特异性的策略策略 S b i oS b i o.t m m u.c o m.c
12、nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司q 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）q 递减递减PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR）q 热启动热启动PCRPCR（HotStart PCRHotStart PCR）q 使用使用PCRPCR增强剂增强剂四种策略四种策略S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司
13、前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之二策略之二 递减递减PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR）S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司 p热启
14、动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度p通常选择热启动Taq酶p热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一策略之三策略之三 热启动热启动PCRPCRS b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司q甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等q可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区q增强剂浓度要适当 策略之四策略之四 使用使用PCRPCR增强剂增强剂升博生物升博生物
15、专业服务专业服务RT-PCR简介简介 S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司主要内容主要内容pRT-PCR原理pRT-PCR步骤p常见问题分析S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Super RnaseH-Reverse Transcriptase35T T T TcDNAT T T T
16、cDNAPCR扩增53mRNAAAAAAAAAPoly(A)*尾3535一步法一步法RT-PCRS b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司两步法与一步法两步法与一步法RT-PCRRT-PCR比较比较两步法一步法引物Oligo dT，随机引物，GSPGSP优点PCR扩增失败时便于分析原因特异性和灵敏度高适用p检测多种目的基因p半定量RT-PCRp大量样品分析p定性S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c
17、o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司p 分析基因的转录水平p 获取目的基因p 合成cDNA探针RT-PCRRT-PCR主要用途主要用途S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司逆转录酶的选择逆转录酶的选择pAMVAMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42，最新版本可达60 （Bioflux公司）。pMMLVMMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶
18、，RNA酶H活性较弱。最适37，最新版本42（赛百盛）pSuper RNaseHSuper RNaseH-Reverse Transcriptase Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42。（Tiangen天根生化）S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司RNase HRNase H的作用的作用p水解水解RNA-DNA杂合链中的杂合链中的RNASupe
19、r RNaseH-Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体逆转录效率高S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司提高提高RT-PCRRT-PCR特异性特异性p提高逆转录酶保温温度提高逆转录酶保温温度 p减少基因组减少基因组DNA污染污染升博生物升博生物 专业服务专业服务RT常见问题常见问题 S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技
20、有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司1.1.RNARNA降解或起始量少降解或起始量少2.2.RNARNA含抑制成分含抑制成分3.3.cDNA 5cDNA 5端不全端不全4.4.目的基因在组织中不目的基因在组织中不 表达或表达量太低表达或表达量太低 原因原因对对策策1.1.分离高质量的分离高质量的RNARNA2.2.使用高温逆转录酶，如使用高温逆转录酶，如RT007RT007（BioFluxBioFlux）3.3.使用随机引物或使用随机引物或GSPGSP4.4.尝试其它组织尝试其它组织问题问题1 1：RT-PCRRT-PCR没有产物没有产物S b i
21、oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司PCRRT-PCR六种六种TaqTaq和和MasterMixMasterMix：TaqTaq、PfuPfu、HotStart HotStart TaqTaq、Taq Taq plusplus、Long Long TaqTaq、Taq PlatinumTaq PlatinumdNTPdNTP引物 SP6,Tn7,M13SP6,Tn7,M13Super Super RNase RNase HH-Reverse Tran
22、scriptaseReverse TranscriptaseTA TA 克隆系统：克隆系统：pBS-T pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒载体、连接和克隆试剂盒pGM-T pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒载体、连接和克隆试剂盒pCF-T pCF-T、pCF-Blunt pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒载体、快速连接试剂盒感受态细胞感受态细胞DNA DNA MarkerMarker：22种不同大小的分子量标准TIANGEN相关产品相关产品升博生物升博生物 专业服务专业服务PCR引物设计引物设计S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c
23、 n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司引物的重要性引物的重要性p引物设计是PCR成功的关键。pPCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。p引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司引物设计一般原则：引物设计一般原则：长度长度p引物的长度一般为15-30 b
24、p，常用的是18-24 bp，但长片段扩增时，引物长度30-35 bp。p引物过短易引起错配现象。例：一个12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点，而20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.p较长的引物（28-35bp)，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司引物设计一般原则：引物设计一般原则：结构结构p尽量避免引物序列形成发夹，特别是3端。p尽量避免
25、引物间形成二聚体、特别是3端前3个碱基间不能有二聚体。p避开局部富含GC或AT，3端避开连续同样的碱基，如GGG，CCC和AT rich.S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司引物设计一般原则：引物设计一般原则：错配错配p尽量避免引物在模板上有错配位点p3端尤其不要形成非特异性结合。p无法避免错配时，最好不要有产物生成。p引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。S b i oS b i o.t m m
26、u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司引物设计一般原则引物设计一般原则:GC含量含量p引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。p上下游引物的GC含量不能相差太大。p不同的算法推荐45-55%或50-60%S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司引物设计软件引物设计软件pPrimer Premier5.0（
27、自动搜索）*pOligo6（引物评价）pVector NTI SuitpDNAsispOmigapDNAstarpPrimer3 （在线服务）S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Primer premier5.0使用简介使用简介主要功能:1、引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司
28、重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Primer premier5.0使用简介使用简介1.1.引物设计最常用软件2.2.引物序列自动搜索功能最强大3.3.简单易用4.4.可用于设计简并引物S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Primer premier5.0使用简介使用简介1.Primer Premier5.0下载、安装。主页之下载中心2.Primer Premier5.0使用演示S b i oS b
29、i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Primer premier5.0使用简介使用简介Primer Premier5.0使用步聚：1.粘贴序列:复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V,选AS is2.PrimerSerch设置引物参数OK3.搜索完成再点OK，选择合要求的引物序列。4.Blast检查引物特异性，必要时重新设计。S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有
30、限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Primer premier5.0使用简介使用简介Primer Premier5.0评价引物方法1.粘贴序列:复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V,选AS is2.PrimerSEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK3.PrimerAEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOKS b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重
31、庆升博生物科技有限公司免费引物设计服务免费引物设计服务1.升博提供免费引物设计服务2.免费引物设计服务注意事项客户提供明确的序列客户明确引物设计要求设计报告以PDF文件提供，打开密码为升博网址。确认合成请再发序列至升博邮箱:S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司Primer Premier使用实例使用实例Human actin-beta Primer设计演示设计演示S b i oS b i o.t m m u.c o m.c nt m m u.c o m.c n重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司重庆升博生物科技有限公司致谢致谢Thank you for your attention!谢谢你的关注！谢谢你的关注！