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1、第七章第七章 蛋白质与氨基蛋白质与氨基酸的测定酸的测定 第一节概述第一节概述第二节各种食品中蛋白质含量及测定意义第二节各种食品中蛋白质含量及测定意义第三节蛋白质换算系数第三节蛋白质换算系数第四节蛋白质的测定方法第四节蛋白质的测定方法 食品分析食品分析第一节第一节 概概 述述 propro是食品的重要组成之一，也是是食品的重要组成之一，也是重要的营养物质，一个食品的营养高低，重要的营养物质，一个食品的营养高低，主要看蛋白质的高低。主要看蛋白质的高低。propro除了保证食除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。味及结构等
2、特征上也起着重要的作用。第七章第七章蛋白质与氨基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定一、一、propro组成与分类组成与分类 1、组组成成pro是是复复杂杂的的含含氮氮有有机机化化合合物物，它它的的溶溶液液是是典典型型的的胶胶体体分分散散体体系系，由由两两性性氨氨基基酸酸通通过过肽肽键键结结合合在在一一起起的的大大分分子子化化合合物物，它它主主要要含含的的元元素素是是C、H、O、N、S、P另另外外还还有有一一些些微微量量元元素素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对对于于不不同同的的pro，它它的的组组成成和和结结构构不不同同，但但从从分分析析数数据据可可以以得得到到近似的近似的pro的元素组成百分比。的元素
3、组成百分比。第一节第一节 概概 述述元素元素元素元素C CHHOONNS SP P百分比百分比百分比百分比%505050507 7 7 723232323161616160 0 0 03 3 3 30 0 0 03 3 3 3 一般来说，一般来说，propro的平均含氮量为的平均含氮量为100/160100/160，所以在用凯氏定氮法定量，所以在用凯氏定氮法定量propro时，将测得的总氮时，将测得的总氮%乘上乘上propro的换称参数的换称参数K=6.25K=6.25即为该物质的即为该物质的propro含量。含量。注意：当测定的样品其含氮的系数与上注意：当测定的样品其含氮的系数与上注意：当测
4、定的样品其含氮的系数与上注意：当测定的样品其含氮的系数与上面面面面100/16100/16100/16100/16相差较大时，采用相差较大时，采用相差较大时，采用相差较大时，采用6.256.256.256.25将会引起显将会引起显将会引起显将会引起显著的偏差。著的偏差。著的偏差。著的偏差。第一节第一节 概概 述述一、一、propro组成与分类组成与分类 2 2 氨基酸的组成氨基酸的组成 上面我们已讲了上面我们已讲了propro是由氨基酸组成是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175175种以上，但是构成种以上，但是构成propro的氨基酸主要是的氨
5、基酸主要是其中的其中的2020种，氨基酸是由脂肪酸碳链上的种，氨基酸是由脂肪酸碳链上的氢原子（氢原子（NH2NH2）所置换而得到的。所置换而得到的。第一节第一节 概概 述述一、一、propro组成与分类组成与分类 二二 propro变性变性 pro pro 受热或其它处理时，它的物理和受热或其它处理时，它的物理和化学性质会发生变化，这个过程称为变性化学性质会发生变化，这个过程称为变性作用，作用，propro发生变性作用后，发生变性作用后，propro的许多性的许多性质发生了变化，溶解度降低，发生凝结，质发生了变化，溶解度降低，发生凝结，形成不可逆凝胶，形成不可逆凝胶，-SHSH暴露在外面，引起
6、暴露在外面，引起propro变性的因素主要是热、酸和碱，化学变性的因素主要是热、酸和碱，化学试剂、重金属盐等。试剂、重金属盐等。第一节第一节 概概 述述第二节第二节 各种食品中蛋白质各种食品中蛋白质的含量及测定意义的含量及测定意义 一一.含量含量 由于食品种类很多，所以由于食品种类很多，所以propro含量分布含量分布是不均匀的，一般动物组织是不均匀的，一般动物组织propro含量高于植含量高于植物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高，豆多于其他部分，植物是以种子含量高，豆类含类含propro最高，如黄豆最高，如黄豆propro
7、含量在含量在40%40%。第七章第七章蛋白质与氨基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定二二.测定意义测定意义 1.1.propro是是组组成成人人体体的的重重要要成成分分之之一一，人人体体的一切细胞都由的一切细胞都由propro组成组成 2.2.propro维持体内酸碱平衡维持体内酸碱平衡 3 3.pro pro 是是食食品品的的重重要要组组织织部部分分之之一一，也也是是重要的营养物质重要的营养物质 4.4.pro pro 是评价食品质量高低的指标，还关是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。系到人体健康。第二节第二节 各种食品中蛋白质的含量及测定意义各种食品中蛋白质的含量及测定意义第三节第三节
8、关于氮关于氮-propro换算等数换算等数 对于氮含量换算成对于氮含量换算成propro含量的等数，含量的等数，历来采用历来采用6.256.25，这个数值是以，这个数值是以propro平均含平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在因食品种类不同，差别是很大的，我们在测定测定propro时，应该是不同的食品采用不同时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换的换算等数，一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查，称等数，用时可查，第七章第七章蛋白质与氨基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定 蛋蛋=6.25=6
9、.25，肉，肉=6.25=6.25，牛乳，牛乳=6.38=6.38，稻米稻米=5.95=5.95，大麦，大麦=5.83=5.83，玉米，玉米=6.25=6.25，小麦小麦=5.83=5.83，麸皮，麸皮=6.31=6.31，面粉，面粉=5.70=5.70，如果手册上查不到的样品则可用如果手册上查不到的样品则可用6.256.25，一般在写报告时要注明采用的换算等数一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。以何物代替。第三节第三节 关于氮关于氮-propro换算等数换算等数第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法 propropropro的的的的测测测测定定定定方方方方法法法法分分分分为
10、为为为两两两两大大大大类类类类：一一一一类类类类是是是是利利利利用用用用propropropro的的的的共共共共性性性性，即即即即含含含含氮氮氮氮量量量量，肽肽肽肽链链链链和和和和折折折折射射射射率率率率测测测测定定定定propropropro含含含含量量量量，另另另另一一一一类类类类是是是是利利利利用用用用蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中特特特特定定定定氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基、酸酸酸酸、碱碱碱碱性性性性基基基基团团团团和和和和芳芳芳芳香香香香基基基基团团团团测测测测定定定定propropropro含含含含量量量量。但但但但是是是是食食食食品品品品种种种种类类类类很很很很多多
11、多多，食食食食品品品品中中中中propropropro含含含含量量量量又又又又不不不不同同同同，特特特特别别别别是是是是其其其其他他他他成成成成分分分分，如如如如碳碳碳碳水水水水化化化化合合合合物物物物，脂脂脂脂肪肪肪肪和和和和维维维维生生生生素素素素的的的的干干干干扰扰扰扰成成成成分分分分很很很很多多多多，因因因因此此此此propropropro的的的的测测测测定定定定通通通通常常常常利利利利用用用用经经经经典典典典的的的的剀剀剀剀氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法是是是是由由由由样样样样品品品品消消消消化化化化成成成成铵铵铵铵盐盐盐盐蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏，用用用用标标标标准准准准酸酸酸酸液液液液
12、吸吸吸吸收收收收，用用用用标标标标准准准准酸酸酸酸或或或或碱碱碱碱液液液液滴滴滴滴定定定定，由由由由样样样样品品品品中中中中含含含含氮氮氮氮量量量量计计计计算算算算出出出出propropropro的的的的含含含含量量量量。由由由由于于于于食食食食品品品品中中中中propropropro含含含含量量量量不不不不同同同同又又又又分分分分为为为为凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮常常常常量量量量法法法法、半半半半微微微微量量量量法法法法和和和和微微微微量量量量法法法法，但但但但它它它它们们们们的的的的基本原理都是一样的。基本原理都是一样的。基本原理都是一样的。基本原理都是一样的。第七章第七章蛋白质与氨
13、基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定 一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 这种方法是这种方法是这种方法是这种方法是1883188318831883年年年年KjeldahlKjeldahlKjeldahlKjeldahl发明，当时凯发明，当时凯发明，当时凯发明，当时凯氏只使用氏只使用氏只使用氏只使用H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4来分解试样，来定量谷物中的来分解试样，来定量谷物中的来分解试样，来定量谷物中的来分解试样，来定量谷物中的propropropro，他只知用他只知用他只知用他只知用H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4分解试样，而不能阐明分解试样，而不能
14、阐明分解试样，而不能阐明分解试样，而不能阐明H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用以只使用以只使用以只使用H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4分解试样，需要较长时间，后来分解试样，需要较长时间，后来分解试样，需要较长时间，后来分解试样，需要较长时间，后来由由由由GunningGunningGunningGunning加入改进，他改进的办法是在消化时加入改进，他改进的办法是在消化时加入改进，他改进的办法是
15、在消化时加入改进，他改进的办法是在消化时加入加入加入加入K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4使沸点上升，这样加快分解速度，因使沸点上升，这样加快分解速度，因使沸点上升，这样加快分解速度，因使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的为温度由原来硫酸沸点的为温度由原来硫酸沸点的为温度由原来硫酸沸点的380380380380上升到上升到上升到上升到400400400400，提，提，提，提高了不到高了不到高了不到高了不到67676767所以速度也就加快了，凯氏定氮所以速度也就加快了，凯氏定氮所以速度也就加快了，凯氏定氮所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用法至今仍
16、在使用法至今仍在使用法至今仍在使用。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法 我们在检验食品中我们在检验食品中propro时，往往只限时，往往只限于测定总氮量，然后乘以于测定总氮量，然后乘以propro核算等数，核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗质氮化合物，故称为粗propro。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法试验仪器图凯氏定氮法试验仪器图1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：不不论论常常量量、半
17、半微微量量以以及及微微量量定定氮氮法法它它们们的的原原理理都都是是一一样样的的，首首先先第第一一个步骤是消化：个步骤是消化：（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的使有机物中的C C、H H氧化为氧化为COCO2 2和和H H2 2O O蒸汽蒸汽逸出，而逸出，而propro则分解氮，则与硫酸结合则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。成硫酸铵，留在酸性溶液中。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快在消化过程中添加硫酸
18、钾可以提高温度加快在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点高反应温度，一般纯硫酸加热沸点高反应温度，一般纯硫酸加热沸点高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330330330330，而添，而添，而添，而添加硫酸钾后，温度可达加硫酸钾后，温度可达加硫酸钾后，温度可达加硫酸钾后，温度可达400400400400，加速了整个反应，加速了整个反应，加速了整个反应，加速了整个反应过
19、程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能增加。加速了有
20、机的分解。但硫酸钾加入量不能增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失，放出氨而造成损失，放出氨而造成损失，放出氨而造成损失。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：（1 1）消化：）消化：为为了了加加速速反反应应过过程程，还还加加入入硫硫酸酸铜铜，氧氧化化汞汞或或硒硒粉粉作作为为催催化化剂剂以以及及加加入入少少量量过过氧氧化化氢氢，次次
21、氯氯酸酸钾钾作作为为氧氧化化剂剂。但但为为了了防防止污染通常使用硫酸铜。止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。碱性反应指示剂。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：（1 1）消化：）消化：（2 2）蒸蒸馏馏：样样液液中中的的硫硫酸酸铵铵在在碱碱性性条条件件下下释释放放出出氨氨，在在这这操操作作中中，一一是是加加入入氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液要要过过量量，二二是是要要防防止止样样液液中中氨
22、气逸出。氨气逸出。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：（3 3）吸收与滴定：）吸收与滴定：蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏过过过过程程程程中中中中放放放放出出出出的的的的氨氨氨氨可可可可用用用用一一一一定定定定量量量量的的的的标标标标准准准准硫硫硫硫酸酸酸酸或或或或标标标标准准准准盐盐盐盐酸酸酸酸溶溶溶溶液液液液进进进进行行行行氨氨氨氨的的的的吸吸吸吸收收收收，然然然然后后后后再再再再用用用用标标标标准准准准氢氢氢氢氧氧氧氧化化化化钠钠钠钠溶溶溶溶液液液液反反反反滴滴滴滴定定定定过过过过剩剩剩剩的的的的硫硫硫硫酸酸酸酸或盐酸溶液，从
23、而计算出总氮量。或盐酸溶液，从而计算出总氮量。或盐酸溶液，从而计算出总氮量。或盐酸溶液，从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。吸收氨的作用。吸收氨的作用。吸收氨的作用
24、。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：操作步骤操作步骤 准确称取样品中准确称取样品中准确称取样品中准确称取样品中0.50-2.000.50-2.000.50-2.000.50-2.00gggg于于于于500500500500mlmlmlml凯凯凯凯氏瓶中氏瓶中氏瓶中氏瓶中加加加加10101010g g g g无水无水无水无水K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4加加加加0.50.50.50.5gCuSOgCuSOgCuSOgCuSO4 4 4 4加加加加20202020ml Hml Hml Hml
25、 H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4在通风橱中先以小火加热，待泡在通风橱中先以小火加热，待泡在通风橱中先以小火加热，待泡在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中继继继继续消化续消化续消化续消化30303030分钟分钟分钟分钟至到样液呈绿色状态，停止至到样液呈绿色状态，停止至到样液呈绿色状态，停止至到样液
26、呈绿色状态，停止消化，冷却消化，冷却消化，冷却消化，冷却加加加加200200200200mlmlmlml水水水水连接蒸馏装置连接蒸馏装置连接蒸馏装置连接蒸馏装置用用用用硼酸作吸收液硼酸作吸收液硼酸作吸收液硼酸作吸收液在在在在K K K K氏瓶中加波动珠数粒和氏瓶中加波动珠数粒和氏瓶中加波动珠数粒和氏瓶中加波动珠数粒和80808080ml50%NaOHml50%NaOHml50%NaOHml50%NaOH立即接好定氮球立即接好定氮球立即接好定氮球立即接好定氮球加热加热加热加热至至至至到到到到K K K K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水氏瓶内残液减少到三分
27、之一时，取出用水氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗冲洗冲洗冲洗用用用用0.10.10.10.1N N N N HCl HCl HCl HCl滴定。滴定。滴定。滴定。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：计算：计算：总总氮氮量量%=%=-100100 0.014-0.014-0.014-0.014-氮的毫克当量数氮的毫克当量数氮的毫克当量数氮的毫克当量数pro%=pro%=pro%=pro%=总氮总氮总氮总氮%K K K K乳乳乳乳 制制制制 品品品品 K=6.38K=6.38K=6.38K=6.38（N=15.7
28、%N=15.7%N=15.7%N=15.7%）小小小小 麦麦麦麦 粉粉粉粉K=5.79K=5.79K=5.79K=5.79（N=17.6%N=17.6%N=17.6%N=17.6%）动动动动 物物物物 胶胶胶胶 K=5.6K=5.6K=5.6K=5.6（N=18.0%N=18.0%N=18.0%N=18.0%）冰冰冰冰 蛋蛋蛋蛋K=6.7K=6.7K=6.7K=6.7（N=14.8%N=14.8%N=14.8%N=14.8%）大大大大豆豆豆豆制制制制品品品品K=6.0K=6.0K=6.0K=6.0（16.7%16.7%16.7%16.7%）K=6.25K=6.25K=6.25K=6.25则则则
29、则（N=16%N=16%N=16%N=16%）K-K-K-K-换称等数换称等数换称等数换称等数第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法1 1、凯氏常量定氮法：凯氏常量定氮法：N（V2-V1）0.014W各种试剂的作用各种试剂的作用（1）浓H H2 2SOSO4 4：A A：脱脱水水使使有有机机物物炭炭化化，然然后后有有机机物物炭炭化化生生成成碳碳，碳碳将将H H2 2SOSO4 4还还原原为为SOSO2 2，本本身身则变为则变为COCO2 2 B B：氧化氧化 C C：propro与与浓浓H H2 2SOSO4 4生生成成NHNH3 3，COCO2 2，SOS
30、O2 2，H H2 2OO D D：NH NH3 3与与H H2 2SOSO4 4生成硫酸铵生成硫酸铵第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法（2）CuSO4的作用（催化剂）CuSOCuSOCuSOCuSO4 4 4 4为为为为红红红红色色色色沉沉沉沉淀淀淀淀，当当当当C C C C完完完完全全全全消消消消化化化化后后后后，反反反反应应应应停停停停止止止止，红红红红色色色色消消消消失失失失，变变变变为为为为兰兰兰兰色色色色，即即即即为为为为消消消消化化化化达达达达到到到到完全，兰色为完全，兰色为完全，兰色为完全，兰色为CuSOCuSOCuSOCuSO4 4 4
31、 4的颜色的颜色的颜色的颜色（3）K2SO4的作用（提高沸点）沸点由沸点由沸点由沸点由330330330330提高到提高到提高到提高到400400400400加速了反应过程。加速了反应过程。加速了反应过程。加速了反应过程。（4 4 4 4）硒硒硒硒粉粉粉粉和和和和过过过过氧氧氧氧化化化化氢氢氢氢，氧氧氧氧化化化化汞汞汞汞都都都都为为为为催催催催化化化化剂剂剂剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜但为了防止污染通常采用硫酸铜但为了防止污染通常采用硫酸铜但为了防止污染通常采用硫酸铜 (5)(5)(5)(5)50%50%50%50%NaOHNaOHNaOHNaOH的作用的作用的作用的作用第四节第四节 蛋白
32、质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法各种试剂的作用各种试剂的作用 下下面面我我就就针针对对几几点点来来说说明明为为何何影影响响氨氨化完全和速度快的因素化完全和速度快的因素（1）K氏烧瓶和取样量 如如果果称称1 1g g以以上上的的样样品品，就就需需要要K K氏氏烧烧瓶瓶最最小小500500mlml，8001000ml8001000ml的的更更好好，这这样样的的K K氏氏烧烧瓶瓶对对于于缩缩短短氨氨化化时时间间，加加热热的的均均匀性和完全氨化效果最好。匀性和完全氨化效果最好。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法（2）分解剂 H H2 2S
33、OSO4 4和和K K2 2SOSO4 4的添加量的添加量有有有有机机机机无无无无分分分分解解解解需需需需要要要要H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4量量量量，H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4应应应应根根根根据据据据有有有有机机机机物物物物种种种种类类类类不不不不同同同同而而而而加加加加的的的的量量量量就就就就不不不不同同同同，如如如如果果果果试试试试样样样样含含含含脂脂脂脂类类类类高高高高，则则则则加加加加H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4多多多多，为为为为了了了了提提提提高高高高分分分分解解解解温温温温度度度度，要要要
34、要大大大大量量量量添添添添加加加加K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4，但但但但不不不不能能能能太太太太多多多多，也也也也不不不不能能能能太太太太少少少少，太少则氨化不充分。太少则氨化不充分。太少则氨化不充分。太少则氨化不充分。K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4和和和和H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4的添加比例是：的添加比例是：的添加比例是：的添加比例是：1 1 1 1g g g g样品样品样品样品 K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4：H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4=7g
35、=7g=7g=7g：12ml12ml12ml12ml 这种比例在国内外都使用，是公认的这种比例在国内外都使用，是公认的这种比例在国内外都使用，是公认的这种比例在国内外都使用，是公认的 还有一种比例：还有一种比例：还有一种比例：还有一种比例：K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4：H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4=10=10=10=10：20ml20ml20ml20ml第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法催化剂用用作作催催化化剂剂的的有有HgHg、HgOHgO、SeSe，硒硒化化合合物物，CuSOCuSO4 4、
36、TiOTiO2 2，对对HgHg，HgOHgO有有毒毒但但结结果果好好，SeSe与与CuSO4CuSO4得得到到结结果果是是一一种种，TiOTiO2 2，的的结结果果偏偏低低，采采用用不不同同的的催催化化剂剂则则消消化化时时间间不不同同，HgOHgO消消化化麦麦子子为为3838，SeSe与与CuSO4CuSO4消消化化麦麦子子5555，TiOTiO2 2消消化化麦麦子子7070，所所以以在在给给出出测测定定结结果果时时要注明催化剂的类型。要注明催化剂的类型。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法（2 2）分解剂）分解剂（3）热源的强度 消消化化时时热热源源的
37、的强强度度同同迅迅速速消消化化和和完完全全氨氨化化关关系系很很大大，即即便便盐盐类类K K2 2SOSO4 4加加得得多多，如如果果热热源源弱弱，也也是是没没有有意意义义的的，热热源源过过强强导导致致H H2 2SOSO4 4损损失失，使使氨氨回回收收率率低低，另另外外K K氏氏瓶瓶的的容容量量大大小小，颈颈部部的的粗粗细细和和长长短短等等，也也与与热热源的强度有关。源的强度有关。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法(4）氨的蒸馏和吸收及滴定 蒸蒸馏馏有有两两种种:1 1 直直接接蒸蒸馏馏（装装置置简简便便，准确性好）准确性好）2 2 水蒸汽蒸馏水蒸汽蒸馏
38、 蒸蒸馏馏加加NaOHNaOH是是50%50%，加加的的量量为为H H2 2SOSO4 4量量的的4 4倍倍，硫硫酸酸量量为为1212mlml，则则NaOHNaOH为为12124=484=48mlml，而而且且一一般般高高于于这这个个理理论论值值，即即加加到到50555055mlml，如如果果NaOHNaOH量量加加的的不不够够就就变变成成H H2 2S S，H H2 2S S是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 吸收液有：1 1、标标准准H H2 2SOSO4 4 用用标标准准碱碱返返滴滴定定，甲甲醛醛红红指指示示
39、剂剂 2 2、硼硼酸酸 用用HClHCl进进行行滴滴定定，混合指示剂混合指示剂 目目前前都都用用硼硼酸酸吸吸收收液液，用用硼硼酸酸代代替替H H2 2SOSO4 4，这这样样可可省省略略了了反反滴滴定定，H H2 2SOSO4 4是是强强酸酸，要要求求较较严严，而而硼硼酸酸是是弱弱酸酸，在在滴滴定定时时，不不影影响响指指示示剂剂变变色色范范围围，另另外外硼硼酸酸为为吸吸收收液液浓浓度度在在3%3%以以上上可可将将氨氨完完全全吸吸收收，为为保保险险期期间一般用间一般用4%4%。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法(4(4）氨的蒸馏和吸收及滴定）氨的蒸馏和吸收
40、及滴定实验注意事项实验注意事项a a.样样品品应应时时均均匀匀的的，若若是是固固体体样样品品应应事事先研细，液体样要混合均匀。先研细，液体样要混合均匀。b b.样样品品放放入入K K氏氏烧烧瓶瓶时时，不不要要黏黏附附瓶瓶颈颈上上，万万一一黏黏附附可可用用少少量量水水缓缓慢慢冲冲下下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。以免被检样消化不完全，使结果偏低。c c.消消化化时时，如如不不容容易易呈呈透透明明溶溶液液，可可将将K K氏氏烧烧瓶瓶放放冷冷后后，加加入入30%30%过过氧氧化化氢氢催催化剂化剂2323mlml，促使氧化。促使氧化。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮
41、法凯氏定氮法d.d.d.d.在在在在整整整整个个个个消消消消化化化化过过过过程程程程中中中中，不不不不要要要要用用用用强强强强火火火火，保保保保持持持持和和和和缓缓缓缓的的的的沸沸沸沸腾腾腾腾，使使使使火火火火力力力力集集集集中中中中在在在在K K K K氏氏氏氏烧烧烧烧瓶瓶瓶瓶底底底底部部部部，以以以以免免免免附附附附在在在在壁壁壁壁上上上上的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在无无无无硫硫硫硫酸酸酸酸存存存存在在在在的的的的情情情情况下，使氮有损失。况下，使氮有损失。况下，使氮有损失。况下，使氮有损失。e.e.e.e.如如如如硫硫硫硫酸酸酸酸缺缺缺缺少少少少，过过过过多多多多的的的的硫硫
42、硫硫酸酸酸酸钾钾钾钾会会会会引引引引起起起起氨氨氨氨的的的的损损损损失失失失，这这这这时时时时会会会会形形形形成成成成硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾，而而而而不不不不与与与与氨氨氨氨作作作作用用用用，因因因因此此此此当当当当硫硫硫硫酸酸酸酸过过过过多多多多底底底底物物物物被被被被消消消消耗耗耗耗掉掉掉掉或或或或样样样样品品品品中中中中脂脂脂脂肪含量过高时，要添加硫酸量。肪含量过高时，要添加硫酸量。肪含量过高时，要添加硫酸量。肪含量过高时，要添加硫酸量。f.f.f.f.混混混混合合合合指指指指示示示示剂剂剂剂在在在在碱碱碱碱性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中呈呈呈呈绿绿绿绿色色色色，在在在在中中
43、中中性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中呈呈呈呈灰灰灰灰色色色色，在在在在酸酸酸酸性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中呈呈呈呈红红红红色色色色，如如如如果果果果没没没没有有有有溴溴溴溴甲甲甲甲酚酚酚酚绿绿绿绿，可可可可单单单单独独独独使使使使用用用用0.1%0.1%0.1%0.1%甲甲甲甲醛醛醛醛红红红红乙醇溶液。乙醇溶液。乙醇溶液。乙醇溶液。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法g.g.氨氨是是否否完完全全蒸蒸馏馏出出来来，PHPH试试纸纸检检查查馏出液是否为碱性。馏出液是否为碱性。h.h.向向蒸蒸馏馏瓶瓶中中加加入入浓浓碱碱时时，往往往往出出现现褐褐色色沉沉淀淀
44、无无。这这时时由由于于分分解解促促进进剂剂与与加加入入的的硫硫酸酸铜铜反反应应，生生成成氢氢氧氧化化铜铜，经经加加热热后后又又分分解解生生成成氧氧化化铜铜的的沉沉淀淀，有有时时CuCu离离子子与与氨氨作作用用生生成成深深兰色的络合物。兰色的络合物。i.i.消化剂绿色后继续消化消化剂绿色后继续消化3030分钟即可。分钟即可。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法2 2、K K氏微量定氮仪法氏微量定氮仪法3 3、K K氏半微量定氮仪法氏半微量定氮仪法(2(2、3 3原理一样原理一样)操操操操作作作作方方方方法法法法大大大大同同同同小小小小异异异异，半半半半微微微
45、微量量量量法法法法消消消消化化化化后后后后，定容定容定容定容100100100100mlmlmlml，然后吸然后吸然后吸然后吸25252525mlmlmlml蒸馏吸收液吸收。蒸馏吸收液吸收。蒸馏吸收液吸收。蒸馏吸收液吸收。N（V2-V1）0.014W N N（V2-V1V2-V1）0.0140.014计算总氮计算总氮%=-%=-100-100-WW 第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法4 4、K K氏自动定氮法氏自动定氮法 原原原原理理理理与与与与上上上上面面面面一一一一样样样样，仪仪仪仪器器器器，采采采采用用用用K K K K氏氏氏氏自自自自动动动动定定
46、定定氮氮氮氮仪仪仪仪：其其其其装装装装置置置置内内内内具具具具有有有有自自自自动动动动加加加加碱碱碱碱蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏装装装装置置置置，自自自自动动动动吸吸吸吸收收收收和和和和滴滴滴滴定定定定装装装装置置置置以以以以及及及及自自自自动动动动数数数数字字字字显显显显示示示示装装装装置置置置，消消消消化化化化装装装装置置置置：由由由由优优优优质质质质玻玻玻玻璃璃璃璃制制制制成成成成的的的的K K K K氏氏氏氏消消消消化化化化瓶瓶瓶瓶以以以以及及及及红红红红外外外外线线线线装置的消化炉。装置的消化炉。装置的消化炉。装置的消化炉。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、一、凯氏定氮法凯氏定
47、氮法氨基酸总量测定氨基酸总量测定propro经经水水解解或或酶酶解解可可由由大大分分子子变变成成小小的的propro成成分分，如如水水解解后后的的产产物物经经胨胨，肽肽等等最最后后成成为为氨氨基基酸酸，氨氨基基酸酸是是构构成成propro最基本的物质。最基本的物质。水水解解后后的的propro和和水水解解前前的的propro在在物物理理特特性性，化化学学结结构构以以及及被被吸吸收收消消化化的的程程度度上上是是很很不不相相同同的的，其其差差别别与与水水解解的的程程度度有有密密切切关关系系，分分析析氨氨基基酸酸的的含含量量就就可可以以知知道道水水解解的的程程度度，也也就就可可以以评价食品的营养价值
48、。评价食品的营养价值。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法 氨氨基基酸酸不不是是单单纯纯的的一一种种物物质质，用用氨氨基基酸酸分分析析仪仪可可直直接接测测定定出出1717种种氨氨基基酸酸（仪仪器器价价格格昂昂贵贵，不不能能普普遍遍使使用用），对对于于食食品品来来说说有有时时有有很很多多种种氨氨基基酸酸可可以以同同时时存存在在于于一一种种食食品品中中，所所以以需需要要测测定定总总的的氨氨基基酸酸量量，它它们们不不能能以以氨氨基基酸酸百百分分率率来来表表示示，只只能能以以氨氨基基酸酸中中所所含含的的氮氮（氨氨基基酸酸态态氮氮）的的百百分分率率表表示示，当当然然，如如果果食食品品中中只只含
49、含有有一一种种氨氨基基酸酸，如如味味精精中中的的谷谷氨氨酸酸，就就可可以以从从含含氮氮量计算出氨基酸的含量。量计算出氨基酸的含量。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法氨基酸总量测定氨基酸总量测定 食食品品在在评评价价蛋蛋白白质质的的营营养养价价值值时时，除除了了测测定定propro的的含含量量，氨氨基基酸酸氮氮含含量量，还还需需要要对对各各种种氨氨基基酸酸进进行行分分离离，鉴鉴定定，尤尤其其对对8 8种种人人体体必必需需氨氨基基酸酸进进行行定定量量定定性分析。性分析。第四节第四节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法氨基酸总量测定氨基酸总量测定单指示剂甲醛滴定法：单指示剂甲醛滴定法：1、
50、原理：氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸具具具具有有有有酸酸酸酸，碱碱碱碱两两两两重重重重性性性性质质质质，因因因因为为为为氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸含含含含有有有有-COOHCOOHCOOHCOOH基基基基，而而而而-COOHCOOHCOOHCOOH基基基基显显显显示示示示酸酸酸酸性性性性，又又又又含含含含有有有有-NHNHNHNH2 2 2 2，-NH-NH-NH-NH2 2 2 2则则则则显显显显示示示示碱碱碱碱性性性性，由由由由于于于于-COOHCOOHCOOHCOOH基基基基和和和和-NH2NH2NH2NH2的的的的相相相相互互互互作作作作用用用用，使使使使氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸成成成成为为为