《12级DNA的生物合成1.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《12级DNA的生物合成1.ppt（71页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第十章第十章核酸的生物合成核酸的生物合成 DNADNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在息以密码的形式编码在DNADNA分子上，表现为特定的核苷酸分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过排列顺序，并通过DNADNA的复制由亲代传递给子代。在后代的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自的生长发育过程中，遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。亲代相似的遗传性状。中
2、中 心心 法法 则则1964-1970 劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录DNA RNA 蛋白质翻译逆转录逆转录1958年，遗传信息的单向 复制：复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。逆转录：逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。Reverse transcription第一节第一节 DNA
3、的生物合成的生物合成一一.DNA的半保留复制的半保留复制(semiconservatie replication)Watson和和Crick开创性的论文，对开创性的论文，对DNA双螺双螺旋的描述以这样一段陈述结尾：旋的描述以这样一段陈述结尾：“不出我们的意不出我们的意料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。物质可能的复制机制。”复制时复制时DNA的两条链分开，以每一条链作模的两条链分开，以每一条链作模板，用碱基配对方式按照单链板，用碱基配对方式按照单链DNA的的(脱氧脱氧)核苷核苷酸顺序合成新链，以组成新酸顺序合成新链，以组成新D
4、NA分子。这样新形分子。这样新形成的两个成的两个DNA分子与原来分子与原来DNA分子的碱基顺序完分子的碱基顺序完全一样全一样,每个子代分子的一条链来自亲代每个子代分子的一条链来自亲代DNA,另另一条链是新合成的一条链是新合成的,这种复制方式即半保留复制。这种复制方式即半保留复制。新链新链旧链旧链DNADNA的半保留复制的的半保留复制的生物学意义：生物学意义：DNADNA的半保留复制表的半保留复制表明明DNADNA在代谢上的在代谢上的稳定性，稳定性，保证亲代保证亲代的遗传信息稳定地的遗传信息稳定地传递给后代。传递给后代。（但（但DNADNA在代谢上的稳在代谢上的稳定性并非指定性并非指DNADNA
5、是一是一种惰性物质。）种惰性物质。）半保留复制半保留复制半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据 1958年年Meselson和和Stahl用同位素用同位素15N标标记大肠杆菌记大肠杆菌DNA，首首先证明了先证明了DNA的半保的半保留复制。留复制。亲亲代代第第一一代代第第二二代代重重轻轻杂和杂和 DNADNA杂和杂和 DNADNA二、复制的起点和方向二、复制的起点和方向（一）概念（一）概念l复制子复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单基因组能独立进行复制的单位成为复制子。位成为复制子。l起点起点(origin)：控制复制起始，是含有控制复制起始，是含有100-200个碱基对的一段
6、个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质的特殊蛋白质(在大肠杆菌中称为在大肠杆菌中称为Dna A蛋白蛋白)。l终点终点(terminus)：终止复制终止复制l复制叉复制叉(replication fork)-复制开始后由于复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构，称为显微镜下可看到的叉状结构，称为复制叉复制叉原核生物：只有一个复制子原核生物：只有一个复制子真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个“复制眼复制眼”或或“复制泡复制泡”（二）起
7、始和方向（二）起始和方向1、原核生物和真核生物复制都是在、原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序守顺序GATC和和TTATCCACA，多次出现，可被多次出现，可被酶识别。酶识别。2、方向：大多是双向对称，也有单向或不对称、方向：大多是双向对称，也有单向或不对称3、速度：、速度：原核生物复制叉移动速度快原核生物复制叉移动速度快(约约105bp/min);真核生物复制叉移动速度慢真核生物复制叉移动速度慢 (约约51025103bp/min)。双向复制双向复制复制叉复制叉起点起点起点起点单向复制单向复制
8、三、原核细胞三、原核细胞DNA的复制的复制（DNA指导下的指导下的DNA合成）合成）l（一）（一）DNA聚合酶聚合酶l1956年年kornberg等首先从大肠杆菌中发现等首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶。其后在广泛不同的生物中都找到有这聚合酶。其后在广泛不同的生物中都找到有这种酶。种酶。DNA模板链模板链引引 物物加入的加入的dNTP脱氧核糖脱氧核糖亲核攻击亲核攻击53底物：底物：dNTP(dATP dGTP dCTP dTTP)；聚合酶（聚合酶（polymerase，DNA-pol):依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶,是是1种种模板指导的酶模板指导的酶模板（模板（template):解开
9、成单链的解开成单链的DNA母链母链；引物（引物（primer):提供提供3-OH末端末端,使使dNTP聚合；聚合；其它酶和蛋白质因子其它酶和蛋白质因子Arthur Kornberg wonthe 1959 Nobel Prizein Medicine for hisdiscovery of the mechanism in the biological synthesis of deoxyribonucleic acid(before Watson and Crick won theirs!)1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶polymerase pol:也称也称Kornberg酶。是各种
10、酶。是各种DNA聚合酶聚合酶中研究的最透彻的，它的一些特点代表了中研究的最透彻的，它的一些特点代表了DNA聚聚合酶的基本特点：合酶的基本特点：（1）pol 的的性质性质 分子量：分子量：10，9000，单链，球形，活性部位，单链，球形，活性部位含含 Zn2，电镜下可以看到二聚体，每个细胞有电镜下可以看到二聚体，每个细胞有400个酶分子。个酶分子。（2）功能：）功能：53聚合聚合酶酶活性；活性；酶与模板结合后构象改变，识别碱基，酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥聚合作用。正确配对后才发挥聚合作用。3 5外切酶活性；外切酶活性；主要是对新生主要是对新生DNA链进行校对，防止链进行校
11、对，防止“错配错配”53外切酶活性；外切酶活性；主要是对主要是对DNA损伤的修复损伤的修复，以及在，以及在DNA复复制时制时RNA引物引物 的切除的切除及其及其空隙的填补空隙的填补模模 板板聚合酶活聚合酶活性位点性位点引物引物3 5 外外切酶位点切酶位点2.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol (1)分子量：分子量：120000，单链，每个细胞，单链，每个细胞100个酶个酶分子。分子。（2）功能：）功能：53聚合聚合酶酶活性；活性；35外切酶活性。外切酶活性。该酶无该酶无5353外切酶活性；且活性很低，外切酶活性；且活性很低，功能尚不清楚功能尚不清楚3.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶
12、 pol DNA复制酶，复制酶，1972年发现年发现 （1）pol 是真正起复制作用的酶是真正起复制作用的酶，由由10种种亚基组成亚基组成不对称二聚体，不对称二聚体，、组成核心酶组成核心酶 （2）功能：）功能：53聚合聚合酶酶活性；活性；35外切酶活性。外切酶活性。该酶在原核细胞中主要负责该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸，链的延伸，是复制延长中真正起催化作用的酶。是复制延长中真正起催化作用的酶。E.coliE.coli DNA DNA 聚合酶聚合酶不对称二聚体不对称二聚体 可滑动的可滑动的 夹持器亚基夹持器亚基催化亚基催化亚基3 5 外切酶亚基外切酶亚基前导链前导链 合成合成后随链后随链
13、 合成合成 夹持器夹持器装置装置催化亚基催化亚基 亚基保持核心酶亚基保持核心酶 的二聚体结构的二聚体结构 亚基具有亚基具有53方向合成方向合成DNA的催化活性；的催化活性；亚亚基具有基具有35外切酶活性，起校对功能，外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶可提高聚合酶复制复制DNA的保真性；的保真性；亚基可能亚基可能起组建的作用起组建的作用；亚基犹如夹子，亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住功能是识别引物、夹住DNA分分 子向前滑动；子向前滑动；t亚基亚基起着促使核心酶二聚化的作用；起着促使核心酶二聚化的作用；其余的亚基构成其余的亚基构成 -复合物复合物，主要功能是帮助主要功能是帮助 亚基夹住亚基夹
14、住DNA（也称夹子装置器），并有增也称夹子装置器），并有增 强核心酶活性的作用。强核心酶活性的作用。DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 亚基数目亚基数目 1 1（单体酶）（单体酶）1 1（多亚基酶（多亚基酶 ）1(1(多亚基酶多亚基酶)5533聚合活性聚合活性 +中中 +很低很低 +很高很高3355外切活性外切活性 +（保护（保护DNADNA复制的复制的忠实性忠实性）5533外切活性外切活性 +-+-主要是对主要是对DNADNA损伤的损伤的修复；以及修复；以及在在DNADNA复复制时切除制时切除RNARNA引物并引物并填补其留下的空隙。填补其留下的
15、空隙。修复紫外光引起修复紫外光引起的的DNADNA损伤损伤DNA DNA 复制的主要复制的主要聚合酶，还聚合酶，还具有具有3 3-5-5 外切酶的外切酶的校对功能，提高校对功能，提高DNADNA复制的保真性复制的保真性1、冈崎片段和半不连续复制、冈崎片段和半不连续复制 （1）冈崎片段：）冈崎片段：逆复制叉合成的小的逆复制叉合成的小的DNA片段，在原核生片段，在原核生物有物有1000-2000核苷酸，真核生物约核苷酸，真核生物约100-200核核苷酸。苷酸。1968年冈崎年冈崎(Okazaki)发现。发现。（2）DNA的半不连续复制：的半不连续复制：DNA双链复制时，一条链是连续合成的双链复制时
16、，一条链是连续合成的（前导链），另一条链是不连续合成的（滞后（前导链），另一条链是不连续合成的（滞后链或后随链），这种前导链的连续复制和后随链或后随链），这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制称链的不连续复制称DNA的半不连续复制。的半不连续复制。（二）双链（二）双链DNA复制的分子机制复制的分子机制复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3535DNA的双向复制的双向复制5555555533333332、DNA半不连续复制中的半不连续复制中的RNA引物引物（1）前导链和滞后链的合成都需要）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物引物（2）引物合成酶）引物合成酶(Dna G)：是以是
17、以DNA为模板的为模板的RNA聚合酶（合成方向聚合酶（合成方向53），合成的引物），合成的引物长度长度5-10nt.(3)引物引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。发酶、模板顺序及其二级结构的影响。（4）DNA聚合酶聚合酶切除前导链及冈崎片段的引物切除前导链及冈崎片段的引物后，填补空缺，由后，填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。连接酶将切口连接。RNA引物的合成称作引物的合成称作“引发引发”。后随链的合成需多次引发作用，而发动前后随链的合成需多次引发作用，而发动前导链的合成只需一次引发。导链的合成只需一次引发。3、DNA连接酶（
18、连接酶（ligase）l催化两段催化两段DNA之间的连接之间的连接35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+DNADNA连接酶（连接酶（19671967年发现）：年发现）：若若双链双链DNADNA中一条中一条链有切口，链有切口，而且而且一端是一端是3 3-OH-OH，另一端是另一端是5 5-磷酸磷酸基基，连接酶可，连接酶可催化催化这两端形成磷酸二酯键，这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。而使切口连接。但是它不能将两但是它不能将两个个游离的游离的DNADNA分子分子连接起来。连接起来。大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶需要连接酶需要NA
19、DNAD+提提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要供能量；在高等生物和噬菌体中，则要ATPATP提供提供能量。能量。T T4 4 DNADNA连接酶可连接连接酶可连接两两个个游离的游离的DNADNA分子分子.3535OHOHP P4.母本母本DNA双链的分离双链的分离 (1)DNA解链酶（解螺旋酶解链酶（解螺旋酶,Dna B）：通过通过水解水解ATP将将DNA两条链打开。每解开一对碱基需两条链打开。每解开一对碱基需要水解要水解2个个ATP分子。分子。(2)单链结合蛋白单链结合蛋白(single-strand binding protein,SSB)：稳定已被解开的稳定已被解开的DNA单链，阻止单
20、链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。复性和保护单链不被核酸酶降解。(3)DNA旋转酶或称拓扑异构酶旋转酶或称拓扑异构酶II：兼有内切酶兼有内切酶和连接酶活性和连接酶活性,可迅速使可迅速使DNA两条链断开又接上两条链断开又接上,消除解链酶产生的拓扑张力。消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时时需要由需要由ATP提供能量，同复制有关。提供能量，同复制有关。除连环数（除连环数（L）不同其他性质均相同的不同其他性质均相同的DNA分子分子称拓扑异构体称拓扑异构体 超螺旋周数超螺旋周数W W：扭曲数扭曲数 拓扑连环数拓扑连环数L L：一条以右手螺旋绕另一条链一条以右手螺旋绕另一条链缠绕
21、的次数。缠绕的次数。缠绕数缠绕数T T：双螺旋的圈数：双螺旋的圈数 B-DNAB-DNA模型螺旋数模型螺旋数 W=L-TW=L-T W=0 W=0 松弛环松弛环 W W为负值为负值 负超螺旋负超螺旋 （右手扭曲）（右手扭曲）W W为正为正 正超螺旋正超螺旋 （左手扭曲）（左手扭曲）总结总结:原核生物原核生物DNADNA的复制过程的复制过程：（以大肠杆菌（以大肠杆菌为例）为例）l 双链的解开双链的解开l起始起始-RNA-RNA引物的合成引物的合成l DNADNA链的延伸链的延伸l 终止终止-切除切除RNARNA引物，填补缺口，连接相邻引物，填补缺口，连接相邻的的DNADNA片段片段B.RNA引物
22、的合成引物的合成 引发体引发体先与先与DNA起始部位双链结合，通过起始部位双链结合，通过引物引物合成酶合成酶形成前导链引物后，再沿形成前导链引物后，再沿53模板链与模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的段的RNA引物。引物。A.双链的解开双链的解开 DNA旋转酶旋转酶(拓扑异构酶拓扑异构酶)、DNA解链酶、解链酶、单链结合蛋白协同作用单链结合蛋白协同作用C.DNA链的延伸链的延伸 在在DNA聚合酶聚合酶的催化下，以四种的催化下，以四种dNTP为底物，在为底物，在RNA引物的引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出端以磷酸二酯键连接
23、上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。前导链的延长：前导链的延长：l DNA聚合酶聚合酶全酶二聚体的一个亚基与前导全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。滞后链的延长滞后链的延长l DNA聚合酶聚合酶全酶二聚体的另一亚基与形成全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。由一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。由于模板形成环，即时酶向沿复制叉方向移动时，于模板形成环，即时酶向沿复制叉方向移动时，滞后链合成片段也能沿滞后链合成片段
24、也能沿53方向生长，与酶方向生长，与酶催化方向一致。滞后链片段合成接近前方滞后催化方向一致。滞后链片段合成接近前方滞后链片段链片段5末端时，模板被释放，环消失。继续末端时，模板被释放，环消失。继续重复，连续进行。重复，连续进行。D.D.复制终止复制终止-切除切除RNARNA引物，填补缺口，连接相引物，填补缺口，连接相邻的邻的DNADNA片段片段 当新形成的冈崎片段延长至一定长度当新形成的冈崎片段延长至一定长度,其其3-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。遇到上一个冈崎片段时即停止合成。复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆菌有复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆菌有一个终止区）。这时会发生一系列
25、变化：一个终止区）。这时会发生一系列变化：1、在、在DNA聚合酶聚合酶催化下切除催化下切除RNA引物；留下的引物；留下的空隙由该酶催化合成一段空隙由该酶催化合成一段DNA填补上；填补上；2、在、在DNA连接酶作用下，连接相邻的连接酶作用下，连接相邻的DNA链；链；3、修复掺入、修复掺入DNA链的错配碱基；以修复方式填补链的错配碱基；以修复方式填补终止区终止区50-100bp的空缺。的空缺。这样以两条亲代这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，互补链，结果形成了两个结果形成了两个DNA双股螺旋分子。双股螺旋分子。复制的保真性（复制的保真性（fidel
26、ity)fidelity)和碱基选择和碱基选择 依赖三种机制依赖三种机制 碱基配对碱基配对:错配率错配率1010-2-2 聚合酶对碱基的选择聚合酶对碱基的选择:错配率错配率1010-2-2 校读功能校读功能:错配率错配率1010-2-2体外合成至少达到的水平体外合成至少达到的水平;体内复制叉的复体内复制叉的复杂结构杂结构;修复系统对错配碱基的检查修复系统对错配碱基的检查;DNA;DNA损损伤修复伤修复5.DNA聚合酶的聚合酶的“校对校对”作用作用lDNA复制的真实性复制的真实性 DNA复制错配率复制错配率10-910-10，大肠杆，大肠杆菌染色体中有菌染色体中有4.5X106bp，每，每100
27、0个细胞个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。l维持维持DNA复制准确性的因素：复制准确性的因素：内因：内因：按碱基配对原则，按碱基配对原则，DNA聚合酶的作用聚合酶的作用 l 对碱基的识别作用；对碱基的识别作用；选择正确的碱基参入到引物末端选择正确的碱基参入到引物末端 对底物的识别作用；对底物的识别作用；先识别引物最后一个碱基是否正确，后识先识别引物最后一个碱基是否正确，后识 别参入的别参入的dNTP是否正确是否正确 校正阅读校正阅读 3 5外切酶的作用外切酶的作用 RNA引物最终被切除，提高了复制的准确性引物最终被切除，提高了复制的准确性l外因：
28、外因：四种四种dNTP要平衡；要平衡；Mn2+和和Mg2+的比例、浓度（酶活）的比例、浓度（酶活）真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 5 5种种 DNA-DNA-polpol DNA-DNA-polpol 、复制延长中催化作用复制延长中催化作用 合成引物合成引物 DNADNA复制复制DNA-DNA-polpol 与与DNA-DNA-polpol I I相似，校对、修复、填补相似，校对、修复、填补DNA-DNA-polpol 线粒体内线粒体内,线粒体合成线粒体合成DNA-DNA-polpol 在无在无其它其它DNA-DNA-polpol时起作用时起作用,修复修复四、真核细胞四、真核细胞DNA
29、的复制的复制（DNA指导下的指导下的DNA合成）合成）在真核细胞内有五种在真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶 （与细菌（与细菌DNADNA聚合聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）定位定位 细胞核细胞核 细胞核细胞核 线粒体线粒体 细胞核细胞核 细胞核细胞核3 3-5-5外切外切 -+-+酶活性酶活性功能功能引物引物 合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制修复修复作用作用真核生物中真核生物中DNADNA的复制特点的复制特点1 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双、真核生物染色体
30、有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。向复制，多复制子。2 2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp.200bp.3 3、真核生物真核生物DNADNA复制速度比原核慢。复制速度比原核慢。4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。制起点。5 5、真核生物有多种、真核生物有多种DNADNA聚合酶。聚合酶。6 6、真核生物线性染色体两端有、真核生物线性染
31、色体两端有端粒端粒结构，防止染色体结构，防止染色体间的末端连接。由间的末端连接。由端粒酶端粒酶负责新合成链负责新合成链5 5 RNARNA引物引物切除后的填补，亦保持切除后的填补，亦保持端粒端粒的一定长度的一定长度。复制叉复制叉复制叉复制叉终止区终止区 端粒结构端粒结构3 3 5 5 3 3 5 5 端粒结构端粒结构端粒结构端粒结构端粒酶是含端粒酶是含RNARNA的逆转录酶的逆转录酶归纳：生物细胞归纳：生物细胞DNADNA复制分子机制的基本特点复制分子机制的基本特点P.254P.254端粒端粒端粒端粒中心粒中心粒图图 真核生物染色体真核生物染色体端粒端粒(telomere)是真核生物线性染色体
32、的两个末是真核生物线性染色体的两个末 端所具有的特殊结构端所具有的特殊结构,由许多成串短的重复由许多成串短的重复序列组成序列组成.其共同特点是一条链上富含其共同特点是一条链上富含T,G短序列短序列的多次重复的多次重复,而其互补链上富含而其互补链上富含A,C.四膜虫端四膜虫端粒重复单位粒重复单位TTGGGG,人人TTAGGG.端粒功能端粒功能:稳定稳定染色体末端结构染色体末端结构,防止染色体间防止染色体间末端连接末端连接,补偿滞后链补偿滞后链5末端在消除末端在消除RNA引物后引物后造成的空缺造成的空缺.前导链前导链前导链前导链RNA引物引物端粒酶端粒酶内在模板内在模板RNA逆转录逆转录,延长延长
33、DNA母链母链移位移位,继续延长母链继续延长母链进一步延长母链进一步延长母链母链藉非标准碱基配对回折母链藉非标准碱基配对回折DNA聚合酶聚合酶端粒合成完成端粒合成完成进一步加工进一步加工 动物生殖细胞中存在端粒酶,端粒一直保持一定长度.体细胞随着分化而失去端粒酶活性,细胞连续分裂会使端粒不断缩短,短到一定程度引起细胞生长停止或凋亡.肿瘤细胞发现端粒酶活性,端粒酶可作为抗癌治疗的靶位点.五五、DNADNA的损伤修复的损伤修复lDNADNA的损伤：的损伤：DNADNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏物化因子如紫外光
34、、电离辐射和化学诱变等，破坏DNADNA的双螺的双螺旋结构。旋结构。从而影响从而影响DNADNA的复制，并使的复制，并使DNADNA的转录和翻译也跟着变的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。化，因而表现出异常的特征（生物突变）。若若DNADNA的损伤或错配得不到修复，会导致的损伤或错配得不到修复，会导致DNADNA突变。其主要突变。其主要形式：形式：一个或几个碱基被置换一个或几个碱基被置换 插入一个或几个碱基插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失一个或多个碱基对缺失u DNADNA的损伤修复的损伤修复 四种修复途径四种修复途径:光复活修复、光复活修复、切除修复、复组修复和
35、诱导修复（亦称暗修复）。切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。u光复活修复：光复活修复：400nm400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上光照射引起的同一条链上TTTT（CC CTCC CT）二聚体。（包括从单细二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）u切除修复：切除修复：将将DNADNA分子中的受损伤部分切除，以完整分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNADNA聚合聚合酶酶、DNADNA外切酶、外切酶、DNADN
36、A连接酶均参与。（发生在连接酶均参与。（发生在DNADNA复制前）复制前）u重组修复重组修复 （发生在复制后）：复制时，跳过损伤部（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。切除但在后代逐渐稀释。u诱导修复：诱导修复：造成造成DNADNA损伤或抑制复制的处理均能引起损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（应急反应（SOS SOS responseresponse）。）。此过程诱导产生切除修复和重组修复此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白
37、和酶，同时产生无校对功能的中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNADNA聚合聚合酶。所以会有酶。所以会有2 2种结果：修复或变异（进化）。种结果：修复或变异（进化）。重组修复重组修复55重组重组修复修复5v定义定义:以以RNARNA为模板，按照为模板，按照RNARNA中的核苷酸顺序中的核苷酸顺序合成合成DNADNA称为反转录，由称为反转录，由逆逆转录酶催化进行。转录酶催化进行。v19701970年年TeminTemin和和BaltimoreBaltimore同时分别从劳氏肉瘤同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒病毒中分中分离出反转录酶，
38、迄今已知的致癌离出反转录酶，迄今已知的致癌RNARNA病毒都含病毒都含有有逆逆转录酶转录酶。六六、反转录作用、反转录作用（RNARNA指导的指导的DNADNA合成）合成）+RNA+RNA+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+v病毒病毒RNARNA的反转录过程的反转录过程 （以前病毒以前病毒形式引起整合到宿形式引起整合到宿主细胞主细胞DNADNA中而使细胞恶性转化）中而使细胞恶性转化）单链病毒单链病毒RNARNA RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子 双链双链DNADNA（前病毒）前病毒）反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶v 逆转录酶是多功能酶，兼有逆转录酶是多
39、功能酶，兼有3 3种酶的活性：种酶的活性：RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性，专一水解的活性，专一水解RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子中的中的RNARNA，可沿可沿5 5 3 3和和3 3 5 5两个方向起核酸外两个方向起核酸外切酶的作用。切酶的作用。v反转录酶也和反转录酶也和DNADNA聚合酶一样，沿聚合酶一样，沿5 53 3方向合成方向合成DNADNA，并要求短链并要求短链RNARNA（DNADNA）作引物。作引物。lcDNAcDNA：利用反转录酶可合成出与任何利用
40、反转录酶可合成出与任何RNARNA模板（模板（mRNAmRNA，tRNAtRNA或或rRNArRNA）的碱基序列互补的的碱基序列互补的DNADNA互补互补DNADNA（cDNAcDNA）。）。几乎所有真核生物几乎所有真核生物mRNAmRNA分子的分子的3 3末端末端都有一段都有一段polyApolyA,当加入寡聚当加入寡聚dTdT作为引物时，作为引物时，mRNAmRNA就可就可作为模板，在反转录酶催化下在体外合成与其互补的作为模板，在反转录酶催化下在体外合成与其互补的cDNAcDNA，为研究真核结构基因提供了有效途径。为研究真核结构基因提供了有效途径。反转录酶发现的理论和实践意义：反转录酶发现
41、的理论和实践意义：不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化，遗传信息也可以从绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前反转录酶的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前反转录酶已经成为研究这些学科的有力工具。已经成为研究这些学科的有力工具。七、七、细菌的限制细菌的限制修饰系统修饰系统限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别的序列具有限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对二次旋转对称性称性,有回文结构有回文结构。限制性核酸内切酶酶切产生限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘
42、性平头末端或粘性末端末端。5GTTAAC33CAATTG55GTT AAC33CAA TTG5平头末端平头末端Hpa 5GAATTC33CTTAAG55G3 5 AATTC33CTTAA5 3G5粘性末端粘性末端EcoR常用的常用的DNA限制性内切酶的专一性限制性内切酶的专一性酶酶辨认的序列和切口辨认的序列和切口说明说明 A G C T T C G A G G A T C C C C T A G G A G A T C T T C T A G A G A A T T C C T T A A G A A G C T T T T C G A A G T C G A C C A G C T G C
43、C C G G G G G G C C C Bam H IAlu IBgl IEco R IHind Sal ISma I四四核苷酸，平端切口核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口II型限制性内切酶的命名lEcoRI E属名、大写，co种名，小写，数字表示不同的酶 再如：HpaI HpaI 表示从同种（属）细菌中分离出的第一种和第二种限制性内切酶。八、八、基因重组与基因重组与DNA“克隆克隆”九、九、聚
44、合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术与技术与DNA扩增扩增聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是是DNA的体外酶促扩增的体外酶促扩增,又称无细胞分子克隆又称无细胞分子克隆.1985年年Mullis K 发明发明PCR 快速扩增快速扩增DNA的方法的方法.PCR方法模仿体内方法模仿体内DNA的的复制过程复制过程,首先首先DNA变性变性,两条两条链解开链解开;引物模板退火引物模板退火,碱基配对碱基配对;DNA聚合酶以聚合酶以4种种dDNP为底物为底物,在引物的引导下在引物的引导下合成与模板互补的合成与模板互补的DNA新链新链.此过程不断重复此过程不断重复,DNA以指数方式扩增以指数方式扩增.PCR反应体系组成：(1)引物 与被分离的目的基因两条链和一端序列互补的DNA引物（通常2030nt)(2)热稳定的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）(3)四种dNTPs(4)作为模板的DNA序列（即要分离的目的DNA）PCR反应原理 53变性并与引物退火延伸变性并与引物退火延伸lPCR热循环：变性：94，4560s退火：一般为引物中较低的Tm减2，1min延伸：72，1min扩增产量：Y=(1+x)nY:产量；x=扩增效率；n=循环次数