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1、课题课题2 2 月季的花药培养月季的花药培养 花中皇后月季又称花中皇后月季又称“月月红月月红”，自然花期自然花期5至至11月月，开花连续不断开花连续不断，通常扦插就可以成活通常扦插就可以成活。知识回顾单倍体育种的过程？单倍体育种的过程？花药离体培养花药离体培养单倍体植株（单倍体植株（N）秋水仙素处理，秋水仙素处理，使染色体加倍使染色体加倍植株（植株（2N）2、明显缩短育种周期、明显缩短育种周期特点：特点：1、后代植株都为纯合子、后代植株都为纯合子正常植株（正常植株（2N）花粉粒（花粉粒（N）3、为新品种的培育开辟了新途径、为新品种的培育开辟了新途径1 1、被子植物定义：、被子植物定义：凡是种子
2、有果皮包被着，凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物实例：梨、杏、玉米、大豆实例：梨、杏、玉米、大豆一、基础知识一、基础知识（一）被子植物的花粉发育（一）被子植物的花粉发育花丝花丝花药：花药：囊状结构，内有很多花粉囊状结构，内有很多花粉2、雄蕊、雄蕊3、花粉的概念花粉的概念:由由花粉母细胞花粉母细胞经过经过 _ 分裂分裂形成的形成的单倍体的单倍体的生殖细胞生殖细胞.减数减数小孢子母细胞小孢子母细胞(花粉母细胞花粉母细胞)减数分裂减数分裂4个小孢子个小孢子（小孢子四分体时期小孢子四分体时期）小孢子单核期小孢子单核期（单核居中期（单核
3、居中期 单核靠边期单核靠边期）有丝分裂有丝分裂每个小孢子每个小孢子花粉管细胞核花粉管细胞核生殖细胞核生殖细胞核（双核期）（双核期）营养细胞营养细胞营养细胞营养细胞生殖细胞生殖细胞生殖细胞生殖细胞有丝有丝有丝有丝分裂分裂分裂分裂2个精子个精子思考：在正常情况下，一思考：在正常情况下，一个小孢子母细胞可以产生个小孢子母细胞可以产生几个精子？几个精子？8个（控制花粉的萌发并提供营养）控制花粉的萌发并提供营养）注意：两个精子和一个营养核的基因型相同注意：两个精子和一个营养核的基因型相同4发育过程发育过程(1)_：4个单倍体细胞连在一起。个单倍体细胞连在一起。(2)单单核核期期：细细胞胞含含有有浓浓厚厚
4、的的_，该该期期又又可可分分为为_和单核靠边期两个时期。和单核靠边期两个时期。（3）双双核核期期：细细胞胞中中含含有有_细细胞胞核核和和_细细胞胞核核，它它们们分分别别形形成成一一个个营营养养细细胞胞和和一一个个生生殖殖细细胞胞，其其中的生殖细胞形成两个精子。中的生殖细胞形成两个精子。四分体时期四分体时期原生原生质质单核居中期单核居中期生殖生殖花粉管花粉管被子植物花粉发育过程中的四分体时期与减数分裂被子植物花粉发育过程中的四分体时期与减数分裂过程中的四分体时期是同一阶段吗？过程中的四分体时期是同一阶段吗？思考思考前者是指前者是指4个单倍体细胞连个单倍体细胞连在一起的时期；后者是指同在一起的时期
5、；后者是指同源染色体配对后，一对同源源染色体配对后，一对同源染色体含有四条染色单体的染色体含有四条染色单体的阶段。阶段。不是不是A.A.花粉是花粉母细胞经有丝分裂形成的花粉是花粉母细胞经有丝分裂形成的B.B.花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期核期和双核期C.C.花粉发育经历的四分体时期与减数分裂的花粉发育经历的四分体时期与减数分裂的四分体时期含义相同四分体时期含义相同D.D.花粉母细胞形成花粉粒中精子的过程是一花粉母细胞形成花粉粒中精子的过程是一系列减数分裂的过程系列减数分裂的过程1.1.下列关于被子植物花粉的形成，说法正确的是下列关于被子植物
6、花粉的形成，说法正确的是BA.A.被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果B.B.花粉粒是在花药中的花粉囊中形成的花粉粒是在花药中的花粉囊中形成的C.C.花粉粒在发育过程中，核先位于细胞中央，花粉粒在发育过程中，核先位于细胞中央，在移到细胞的一侧在移到细胞的一侧D.D.被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段期、单核期和双核期等阶段A2.下列关于被子植物花粉发育的说法，不正确下列关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是的是（二）产生花粉植株的两种途径（二）产生花粉植株的两种途径移栽移栽花药中花药中的花
7、粉的花粉胚状体胚状体脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织花药中花药中的花粉的花粉脱分化脱分化分化分化丛芽丛芽再分化再分化丛芽丛芽诱导诱导生根生根1途径差异：途径差异：2形成原因：形成原因：主要取决于培养基中主要取决于培养基中激素激素的种类及其浓度配比。的种类及其浓度配比。3、体细胞胚（胚状体）：、体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为程亦与合子胚类似，被称为体细胞胚（胚状体）体细胞胚（胚状体）。A.A.花粉通过胚状体阶段直接发育成植株花粉
8、通过胚状体阶段直接发育成植株B.B.花粉先形成愈伤组织在诱导分化成植株花粉先形成愈伤组织在诱导分化成植株C.C.花粉经脱分化形成胚状体，在分化出根，然花粉经脱分化形成胚状体，在分化出根，然后诱导生芽后诱导生芽D.D.两种途径并无绝对的界限，主要取决于培两种途径并无绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类和浓度比例养基中激素的种类和浓度比例C3.下列对产生花粉植株途径的叙述，不正确下列对产生花粉植株途径的叙述，不正确的是的是4、下面是被子植物花粉发育过程的简略表示，请回答：下面是被子植物花粉发育过程的简略表示，请回答：小孢子母细胞小孢子母细胞双核期双核期(1)是指是指_时期，由小孢子母细胞经时期
9、，由小孢子母细胞经_分分裂形成。裂形成。(2)和和分别是指分别是指_期和期和_期，该期细胞期，该期细胞的特点是的特点是_。(3)1个花粉母细胞经过分裂最多能形成个花粉母细胞经过分裂最多能形成_个花粉个花粉粒，粒，_个细胞核。个细胞核。(4)双核期的两个核分别叫双核期的两个核分别叫_核和核和_核。核。四分体四分体减数减数单核居中单核居中单核靠边单核靠边含浓厚的原生质含浓厚的原生质412生殖细胞生殖细胞花粉管细胞花粉管细胞5 5、某二倍体植物是杂合体，图为其花药中未成熟花粉在适宜的、某二倍体植物是杂合体，图为其花药中未成熟花粉在适宜的培养基上培养产生完整植株的过程。据图回答：培养基上培养产生完整植
10、株的过程。据图回答：（1）图中）图中表示的是该花粉培养过程中的表示的是该花粉培养过程中的_过程，过程，表表示的是示的是_过程，过程，X代表的是代表的是_，表示的是表示的是_过过程，程，表示的是诱导表示的是诱导_过程。过程。（2）图中从愈伤组织形成完整植株的途径有两条，具体通过那）图中从愈伤组织形成完整植株的途径有两条，具体通过那一条途径主要取决于培养基成分中一条途径主要取决于培养基成分中_的种类及其浓度的种类及其浓度配比，最后获得的来源于未成熟花粉的完整植株都称为配比，最后获得的来源于未成熟花粉的完整植株都称为_植株。未成熟花粉经培养能形成完整植株，说明未成熟花粉具植株。未成熟花粉经培养能形成
11、完整植株，说明未成熟花粉具有有_。脱分化脱分化再分化再分化胚状体胚状体分化分化生根生根激素激素单倍体单倍体细胞全能性细胞全能性6、结合教材内容填下列示意图：小孢子母细胞（2n）（）时期（n）单核（）期（n）双核期（）细胞核（n）（）细胞核（n）（）细胞（n）（）细胞（n）（）个精子(n)（）分裂（）分裂单核（）期（n）（）分裂(三三)、影响花药培养的因素、影响花药培养的因素1 1、材料的选择、材料的选择不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对
12、诱导成功率也有直接影响说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响选材是否成功是花药培养成功的关键选材是否成功是花药培养成功的关键选材是否成功是花药培养成功的关键选材是否成功是花药培养成功的关键选材选材一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期单核靠边期花药培养时期的选择花药培养时期的选择主要因素：主要因素：材料的选择材料的选择 和和
13、 培养基的组成培养基的组成选择单核期以前的花药接种，选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破质地幼嫩，极易破碎碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药的花药。其它其它时期选择的缺点时期选择的缺点为了挑选到单核期的花药，为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开通常选择完全未开放的花蕾。放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。作实验材料。选择完全未开放花蕾的原因选择完全未开放花蕾的原因 完全未开放的花蕾，可挑选到单核期
14、的花完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒药，菌少、易消毒单核期花药的挑选单核期花药的挑选花药培养时间花药培养时间一般月季的花药培养时间选在五月初到五月的中一般月季的花药培养时间选在五月初到五月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可能提高花粉的诱导成功率生理状态会比较好，可能提高花粉的诱导成功率2 2、培养基的组成、培养基的组成花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同而有所变化而有所变化3 3、其他因素、其他因素亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及亲本植株的生长条件、
15、材料的低温预处理以及接种的密度等对诱导成功都有一定的影响接种的密度等对诱导成功都有一定的影响1、影响花药培养的主要因素是影响花药培养的主要因素是（）A A材料的选择与培养基的组成材料的选择与培养基的组成 B B亲本植株的生亲本植株的生理状况理状况 C C选择合适的花粉发育时期选择合适的花粉发育时期 D材料的低温处材料的低温处理与接种密度理与接种密度2 2、月季花药培养时的花粉粒最好是（、月季花药培养时的花粉粒最好是（）A A、四分体时期、四分体时期 B B、单核居中期、单核居中期 C C、单核靠边期、单核靠边期 DD、二核或三核花粉粒、二核或三核花粉粒C CA A五、实验操作五、实验操作（一）
16、材料的选取（一）材料的选取某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙焙花青花青-铬矾法，铬矾法，这种方法能将这种方法能将花粉细胞核染成花粉细胞核染成蓝黑色。蓝黑色。最常用的方法有最常用的方法有醋酸洋红法醋酸洋红法1 1、方法、方法从花药看从花药看：月季的初花期：月季的初花期 从花粉看：从花粉看：单核期单核期 从花蕾看从花蕾看：完全未开放的：完全未开放的 醋酸洋红法染色机理醋酸洋红法染色机理醋酸洋红为醋酸洋红为醋酸洋红为醋酸洋红为碱性染色剂碱性染色剂碱性染色剂碱性染色剂，而花粉细胞内有染色体，染，而花粉细胞内有染色体，染，而花粉细胞内有染色体，染，而花粉细胞内有染
17、色体，染色体主要成分是色体主要成分是色体主要成分是色体主要成分是DNADNADNADNA和蛋白质和蛋白质和蛋白质和蛋白质,易被碱性染料着色易被碱性染料着色易被碱性染料着色易被碱性染料着色染成染成染成染成红色红色红色红色 。将体积分数将体积分数将体积分数将体积分数45454545的醋酸的醋酸的醋酸的醋酸100ml100ml100ml100ml煮沸，缓缓加入煮沸，缓缓加入煮沸，缓缓加入煮沸，缓缓加入1g1g1g1g洋洋洋洋红，在加热回流红，在加热回流红，在加热回流红，在加热回流8h8h8h8h，冷却至，冷却至，冷却至，冷却至50505050，过滤即可。，过滤即可。，过滤即可。，过滤即可。醋酸洋红的
18、配置醋酸洋红的配置2 2、醋酸洋红法、醋酸洋红法染色操作染色操作 花药（载玻片上）花药（载玻片上）1%的醋酸洋红的醋酸洋红1滴滴用镊柄将花药捣碎，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）将将将将5g5g5g5g铬明矾铬明矾铬明矾铬明矾KKKK2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4CrCrCrCr2 2 2 2(SO(SO(SO(SO4 4 4 4)24H24H24H24H2 2 2 2OOOO加入加入加入加入90ml90ml90ml90ml蒸馏蒸馏蒸馏蒸馏水中，溶解后加入水中，溶解后加入水中，溶解后加入水中，溶解后加入0.1g
19、0.1g0.1g0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，焙花青，混匀并加热至沸腾，焙花青，混匀并加热至沸腾，焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸煮沸煮沸煮沸5 5 5 5分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ml100ml100ml100ml。焙花青焙花青铬钒溶液的配制方法铬钒溶液的配制方法染色操作染色操作3 3、焙花青、焙花青铬钒法铬钒法将无水酒精与冰醋酸按体积比为将无水酒精与冰醋酸按体积比为将无水酒精与冰醋酸按体积比为将无水酒精与冰醋酸按体积比为3 3 3 3：1 1 1 1的比例混
20、匀的比例混匀的比例混匀的比例混匀卡诺氏固定液的配制方法卡诺氏固定液的配制方法 花药（在卡诺氏固定液中处理花药（在卡诺氏固定液中处理20min）取出，置于载玻片上取出，置于载玻片上焙花青铬矾溶液染色焙花青铬矾溶液染色盖上盖玻片盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）被染成蓝黑色）5 5、无菌水冲洗、无菌水冲洗3 35 5次次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用、花蕾用体积分数为体积分数为70%的酒精的酒精浸泡浸泡30秒秒2、无菌水清洗、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4
21、、放入、放入质量分数为质量分数为0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中24分钟分钟 （质量分数为质量分数为1%的的次氯酸钙溶液次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液或饱和漂白粉溶液）（二）材料的消毒（二）材料的消毒为什么花瓣松动会给为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？材料的消毒带来困难？花瓣松动后，微生物就花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难的消毒带来困难。为什么花瓣松动会给为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？材料的消毒带来困难？（三）接种和培养（三）接种和培养 1 1 灭菌后花蕾，要在灭菌后花蕾，要在 下除去萼片和花瓣，下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培
22、养基上。并立即将花药接种到培养基上。3 通常每瓶接种花药通常每瓶接种花药 ，温度控制在，温度控制在 左左右，右，。幼小植株形成后才。幼小植株形成后才 。2 在剥离花药时，要尽量在剥离花药时，要尽量 （否则接种后，否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻），同时还要彻底底 ，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成胚状体的形成。一般经过一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织愈伤组织或释放出胚状体或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便。将
23、愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。进一步分化出再生植株。4 进一步鉴定和筛选：进一步鉴定和筛选：常常会出现染色体倍性的变化常常会出现染色体倍性的变化无菌条件无菌条件不损伤花药不损伤花药去除花丝去除花丝7-10个个25不需要光照不需要光照需要光照需要光照主要原因是主要原因是花粉管核和花粉管核和生殖核融合生殖核融合造成的造成的植物组织培养技术与花药培养技术的比较植物组织培养技术与花药培养技术的比较项目项目植物组织培养植物组织培养花药培养技术花药培养技术相同点相同点1 培养基配制方法、无菌技术及接种操作培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。等基本相同。2 都经过了脱分
24、化都经过了脱分化不同点不同点1 离体培养的外植体为离体培养的外植体为体细胞体细胞。2 有丝分裂的过程，有丝分裂的过程，染染色体数量不变色体数量不变。1 花粉是花粉是生殖细胞生殖细胞，得，得到的到的单倍体植株单倍体植株，弱小，弱小且高度不育。且高度不育。2秋水仙素处理，染色秋水仙素处理，染色体加倍，恢复正常的染体加倍，恢复正常的染色体数，为色体数，为纯种纯种纯种纯种。课题成果评价课题成果评价一一 选材是否恰当选材是否恰当二二 无菌技术是否过关无菌技术是否过关三三 接种是否成功接种是否成功人工种子：胚状体人工种子：胚状体/顶芽顶芽/不顶芽等不顶芽等+人工种皮人工种皮+人工胚乳人工胚乳课外知识课外知
25、识练习：小麦高杆（练习：小麦高杆（D）对矮杆（）对矮杆（d）为显性，抗锈病（）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（）对不抗锈病（t）为显）为显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种，性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种，可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：高杆抗锈病（高杆抗锈病（DDTT）矮秆不抗锈病矮秆不抗锈病 （ddtt）F1：的基因型和表现型的基因型和表现型a各种配子的种类各种配子的种类a符合要求的单倍体的基因型符合要求的单倍体的基因型良种的基因型表现型良种的基因型表现型单倍体育种方法的主要优点
26、是单倍体育种方法的主要优点是。1 可以明显缩短育种年限可以明显缩短育种年限2 后代为纯合子后代为纯合子P：DdTt，高秆抗锈病，高秆抗锈病DT，Dt,dT,dtddTT矮秆锈病矮秆锈病杂交育种杂交育种花药离体培养花药离体培养DT，Dt,dT,dt秋水仙素处理秋水仙素处理下图是月季花药离体培养产生花粉植株的两种途径，下图是月季花药离体培养产生花粉植株的两种途径，请据图回答有关问题：请据图回答有关问题：1 1）选用的材料合适与否是成功诱导出花粉植株的）选用的材料合适与否是成功诱导出花粉植株的重要因素，一般来说选用重要因素，一般来说选用 期的花粉可提高成期的花粉可提高成功率。选择花粉时，一般要通过功
27、率。选择花粉时，一般要通过 来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是 。单核单核镜检（显微镜观察）镜检（显微镜观察）醋酸洋红醋酸洋红2 2）上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取）上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中决于培养基中 。3 3）胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织）胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织的细胞排列疏松无规则，是一种高度的细胞排列疏松无规则，是一种高度 的薄壁细胞，胚状体与的薄壁细胞，胚状体与 发育形成的胚有类发育形成的胚有类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。4 4）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，请说）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，请说明下列各项需要消毒，还是需要灭菌。明下列各项需要消毒，还是需要灭菌。培养基，培养基，培养皿，培养皿，接种环，接种环，花蕾，花蕾，实验实验操作者的双手，操作者的双手，三角锥形瓶。三角锥形瓶。（填编号）（填编号）需要灭菌，需要灭菌，（填编号）需要消毒。（填编号）需要消毒。激素的种类及其浓度配比激素的种类及其浓度配比液泡化液泡化正常受精卵正常受精卵花的结构花的结构