第八章 核酶和抗体酶.ppt

《第八章 核酶和抗体酶.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第八章 核酶和抗体酶.ppt（58页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、退出 Enzyme Engineering酶工程第八章第八章 核酶和抗体酶核酶和抗体酶第一节第一节 核核酶 第二节第二节 脱氧核酶脱氧核酶 第三节第三节 抗体酶抗体酶 第一节第一节 核核酶一、一、核核酶的发现的发现 二、二、核核酶的种类的种类 三、三、核核酶的应用现状的应用现状 1982年美国年美国T.Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNA前前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现现RNA有催化活性有催化活性 Thomas Cech University of Colorado at Boulder,USA 一、一、核核酶的发现的发

2、现 1983年美国年美国S.Altman等研究等研究RNaseP（由由20%蛋白蛋白质和质和80%的的RNA组成），发现组成），发现RNaseP中的中的RNA可催可催化化E.coli tRNA的前体加工的前体加工 Sidney Altman Yale University New Haven,CT,USA 一、一、核核酶的发现的发现 Cech和和Altman各自独立地发现了各自独立地发现了RNA的的催化活性，并命名这一类酶为催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核核酶），酶），2人共同获人共同获1989年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖1Cell,vol 31,147157,1982 2Sci

3、.Amer.,Vol 255,6475,1986 二二、核核酶的种类的种类 剪接型核酶剪接型核酶剪切型核酶剪切型核酶根根据据催催化化反反应应锤头核酶锤头核酶I I型内含子型内含子IIII型内含子型内含子发夹核酶发夹核酶丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDV)核酶核酶RNaseP1、剪接型、剪接型核核酶n剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子(Intron)n型型内含子内含子：均与四膜虫的核：均与四膜虫的核rRNA前体的前体的内含内含子子结构相似，催化自我剪接需鸟苷（或结构相似，催化自我剪接需鸟苷（或5鸟苷酸）鸟苷酸）和和Mg2+(Mn2+)参与参与n型内含子型内含子：结构与四膜虫的不同

4、，而与细胞核：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的前体中的内含子内含子相似。它催化自我剪接反相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+2、剪切型、剪切型核核酶n只剪不接只剪不接 (1)自身催化剪切型自身催化剪切型RNA (2)异体催化剪切型异体催化剪切型RNA(1)自身催化剪切型自身催化剪切型RNA 剪切机制剪切机制 类型类型 锤头型锤头型 发夹结构发夹结构 HDV RNAl 核糖核酸酶核糖核酸酶P(RNaseP)。是核糖核蛋白体复合物，。是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有能剪切所有tRNA前体的前体的5端，除去多余的序列，形成端，除

5、去多余的序列，形成3-OH 和和 5-磷酸末端磷酸末端l 由由M1RNA和蛋白质亚基组成和蛋白质亚基组成l 体外：体外：M1RNA具催化作用具催化作用 蛋白质作为辅助因子蛋白质作为辅助因子 体内：体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的和蛋白质对酶活性都是必需的l M1RNA 5端完整结构对维持催化活性是必需的。端完整结构对维持催化活性是必需的。反应需反应需Mg 2+参与参与(2)异体催化剪切型异体催化剪切型RNA三、三、核核酶的应用现状的应用现状1 1、核酶在医学上的应用、核酶在医学上的应用 核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝

6、炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶 抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-基因表达，并率先进入临床期 抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的三、三、核核酶的应用现状的应用现状1 1、核酶在医学上的应用、核酶在医学上的应用特点 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强专一性强 免疫源性低，很少引起免疫反应免疫源性低，很少引起免疫反应

7、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运三、三、核核酶的应用现状的应用现状2 2、在其他领域的应用、在其他领域的应用防治动、植物防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等克隆等三、三、核核酶的应用现状的应用现状核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题 核酶催化切割反应的可核酶催化切

8、割反应的可 逆性问题逆性问题 提高催化效率提高催化效率 寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 使核酶在细胞内有调控地高效表达使核酶在细胞内有调控地高效表达 增强核酶在细胞内的稳定性增强核酶在细胞内的稳定性 对宿主的损伤问题有待进一步考察对宿主的损伤问题有待进一步考察第一节结束第一节结束核核酶的发现的发现 核核酶的种类的种类 核核酶的的应用现状应用现状剪接型剪接型剪切型剪切型第一节结束第一节结束n点击返回 第二节第二节 DNA(脱氧脱氧)核酶核酶 一、一、DNA核酶概念及其结构核酶概念及其结构 二、二、DNA核酶的催化特性核酶的催化特性三、三、DNA核

9、酶的反应动力学特征核酶的反应动力学特征四、四、DNA核酶的生物学意义核酶的生物学意义一、一、DNA核酶概念及其结构核酶概念及其结构概念概念 n具有酶活性的具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶分子称为脱氧核酶(deoxyribozyme或或DNAzyme)RY RRNA substrate切割点切割点R=A or GY=C or Udeoxyribozyme 5 3 一、一、DNA核酶概念及其结构核酶概念及其结构结构结构 nSantoro和和Joyce等通过体外选择技术提出了一等通过体外选择技术提出了一种通用于种通用于RNA切割的脱氧核酶分子：切割的脱氧核酶分子：10-23型型一、一、DNA核酶概

10、念及其结构核酶概念及其结构结构结构 nCarmi等通过体外选择技术合成了一种依赖等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子茎茎II(催化部位催化部位)茎茎I(结合部位结合部位)5 3 C A切割点切割点102030 40二、二、DNA核酶的催化特性核酶的催化特性1、催化效率高、催化效率高 2、高度专一性、高度专一性 3、活性依赖金属离子、活性依赖金属离子 4、其它辅助因子、其它辅助因子三、三、酶促反应动力学特征酶促反应动力学特征1、pH值和温度对酶反应速率的影响值和温度对酶反应速率的影响nDNADNA核酶

11、核酶PS5.MPS5.M在在pH4-8pH4-8内，反应速率随内，反应速率随pHpH上升而增上升而增大，在大，在pH6.2pH6.2左右达最大值，随后下降；最适温度左右达最大值，随后下降；最适温度在在4040左右左右2、激活剂、激活剂n金属离子：金属离子：K K+、NaNa+、MgMg2+2+、MnMn2+2+等；组氨酸；等；组氨酸；H H+等等3、酶浓度对酶反应速率的影响、酶浓度对酶反应速率的影响n符合米氏方程，具酶催化特性符合米氏方程，具酶催化特性RY RRNA substrate切割点切割点R=A or GY=C or Udeoxyribozyme 5 3 四、四、生物学意义生物学意义三

12、种脱氧核酶的活性：三种脱氧核酶的活性：连接酶活性连接酶活性金属螯合酶活性金属螯合酶活性磷酸酯酶活性磷酸酯酶活性研究生命起源研究生命起源第二节结束第二节结束概念及其结构概念及其结构 催化特性催化特性 反应动力学特征反应动力学特征 生物学意义生物学意义催化效率高催化效率高 高度专一性高度专一性 活性依赖金属离子活性依赖金属离子 其它辅助因子其它辅助因子pH值和温度对酶反应速率的影响值和温度对酶反应速率的影响 激活剂激活剂 酶浓度对酶反应速率的影响酶浓度对酶反应速率的影响第二节结束第二节结束n点击返回 第三节第三节 抗体酶抗体酶一、一、抗体酶概述抗体酶概述二、二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应三、

13、三、抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法四、四、抗体酶研究展望抗体酶研究展望 一、一、抗体酶概述抗体酶概述 概念概念 是一种具有催化功能的免疫球蛋白是一种具有催化功能的免疫球蛋白(抗体分子抗体分子)，在其可变区赋予了酶的属性，属于化学人工酶在其可变区赋予了酶的属性，属于化学人工酶 酶与抗体的差别酶与抗体的差别n酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的非催化性物质体是和基态分子结合的非催化性物质二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应1、酰基转移反应、酰基转移反应 二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应2、重排反应、重排反应二二、抗体酶的

14、催化反应抗体酶的催化反应3、氧化还原反应、氧化还原反应二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应4、金属螯和合反应、金属螯和合反应二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应5、磷酸酯水解反应、磷酸酯水解反应二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应6、磷酸酯闭环反应、磷酸酯闭环反应二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应7、光诱导反应光诱导反应na.光聚合反应（二聚作用）光聚合反应（二聚作用）二二、抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应7、光诱导反应光诱导反应nb.光裂解反应光裂解反应三、三、抗体抗体酶的的制备方法制备方法 1、拷贝法、拷贝法 2、引入法、引入法1、拷贝法拷贝法n用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体

15、，再将此抗体免用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶n缺点缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶2、引入法引入法n将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术工程技术四、四、抗体酶研究展望抗体酶研究展望n研究

16、酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律的一般规律n获得一类新型的蛋白酶获得一类新型的蛋白酶n催化天然酶不能催化的反应催化天然酶不能催化的反应第三节结束第三节结束抗体酶概述抗体酶概述抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应 抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法抗体酶研究展望抗体酶研究展望酰基转移反应酰基转移反应 重排反应重排反应 氧化还原反应氧化还原反应 金属螯和合反应金属螯和合反应 磷酸酯水解反应磷酸酯水解反应 磷酸酯闭环反应磷酸酯闭环反应 光诱导反应光诱导反应拷贝法拷贝法引入法引入法第三节结束第三节结束n点击返回 型型内内含含子子的的剪剪接接机机制制p

17、G-OHp3 pP-GOHp P-G3HO Mg 2+或或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)5IVSL-19IVSUCUAAAGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVS19nt53rRNA535pGOH353四四膜膜虫虫rRNA前前体体自自我我剪剪接接反反应应 型内含子二级结构通式型内含子二级结构通式保守序列保守序列G结合位点结合位点剪接部位剪接部位引导序列引导序列型型内内含含子子的的剪剪接接机机制制p 2 HO-Ap

18、p-A p3OHpP-AHO 3Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外显子连接类内含子有一个保类内含子有一个保守的二级结构：守的二级结构：结构域结构域：两个保守：两个保守内含子结构序列内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外与两个外显子结构序列显子结构序列IBS1,IBS2互相配对互相配对结构域结构域：高度保守，：高度保守，催化活性必需催化活性必需结构域结构域：A 提供提供2-OH 型内含子二级结构通式型内含子二级结构通式5 3 这类这类RNA进行自进行自身催化的反应是只切身催化的反应是只切不接。不接。特点特点：在：在 Mg 2+或其或其他二价金属离子存在他二价金属离子存在下，在特定的

19、位点，下，在特定的位点，自我剪切，产生自我剪切，产生5-OH 和和2，3-环磷酸环磷酸二酯末端二酯末端。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应锤头型核酶的二级结构锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图和空间立体结构示意图三个双螺旋区三个双螺旋区13个核苷酸残基保个核苷酸残基保守序列守序列剪切反应在右上方剪切反应在右上方GUX序列的序列的3端自端自动发生动发生催化过程需要二价催化过程需要二价金属离子参与金属离子参与17位（位（X）的核苷酸残的核苷酸残基多数是基多数是C,不能是不能是U,G.7位核苷酸残基的置换位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大不会对酶活性产生很大影响影响锤

20、头二级结构编号锤头二级结构编号7位核苷酸位核苷酸17位核苷酸锤头结构的锤头结构的 五种类型五种类型R示酶，示酶，S示底物，箭头示剪切位点示底物，箭头示剪切位点发夹（发夹（hairpin）结构结构发夹核酶发现于三种不同植物发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链均为单链RNA发夹核酶催化机制发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应中起

21、结金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高5个环和个环和4个螺旋形成两个个螺旋形成两个结构域结构域剪切反应发生在底物识别剪切反应发生在底物识别序列序列GUC的的5端端两个内部环中的碱基及在两个内部环中的碱基及在螺旋区螺旋区的的G11和底物中和底物中的的G+1都是酶发挥作用所都是酶发挥作用所必需的必需的53 发夹二级结构模型剪切位点剪切位点HDV RNA斧头结构模式 三个碱基对的茎三个碱基对的茎需要二价阳离子，需要二价阳离子，产生产生5-OH和和 2,3-环磷酸环磷酸剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGCAUUCCGAGGGGAC CAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCU U C C G C C UCAGGUAAGCG35剪切剪切位点位点 HDV 核酶假结样结构核酶假结样结构L3L4J1/2 J1/4J2/4四个螺旋区，三个连接区，两四个螺旋区，三个连接区，两个环个环活性中心区：活性中心区：J1/4,J2/4,L3剪切位点：剪切位点：688/689