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1、Chapter 6Chapter 6 Microbial Growth and Its Control 微生物的生长繁殖及其控制微生物的生长繁殖及其控制 第第 一一 节节 生长的定义及测定方法生长的定义及测定方法 微生物生长微生物生长(Growth)：是指细胞物质有是指细胞物质有规律地、不可逆增加的生物过程。规律地、不可逆增加的生物过程。微生物繁殖微生物繁殖(Reproduction)：是微生物是微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复制和重建导致产生新的生命个体，构的复制和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学即引起生命个体数量增
2、加的整个生物学过程。过程。一、一、测生长量测生长量（一）直接法：（一）直接法：测体积法；测体积法；称干重法称干重法（二）计繁殖数（二）计繁殖数1、比浊法、比浊法2、生理指标法、生理指标法 1、比浊法、比浊法菌液菌液浓度浓度吸光吸光值值（OD值）值）2.2.生理指标测定法生理指标测定法测含氮量法测含氮量法 蛋白质总量蛋白质总量=含氮量含氮量 6.25 细胞总量细胞总量=蛋白质总量蛋白质总量/（50%80%（或（或65%）=蛋白总量蛋白总量1.54测含碳量以及测磷、测含碳量以及测磷、DNA、RNA、ATP、DAP（二氨基庚二酸）、几丁质等。二氨基庚二酸）、几丁质等。产酸、产气、耗氧、粘度和产热等。
3、产酸、产气、耗氧、粘度和产热等。二、计繁殖数二、计繁殖数1、直接计数法直接计数法2、间接计数法间接计数法1、直接计数法：指用计数板在光学显微镜下直接、直接计数法：指用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。观察细胞并进行计数的方法。2、间接计数法间接计数法（1）平板菌落计数法）平板菌落计数法（2）膜过滤法）膜过滤法（1）平板菌落计数法：）平板菌落计数法：浇注平浇注平板或板或涂布平板涂布平板（2）膜过滤法）膜过滤法第二节、微生物的生长规律第二节、微生物的生长规律一、纯培养技术一、纯培养技术1、纯培养的定义：、纯培养的定义：纯培养纯培养(Pure culture)：微生物学中微生物学中将
4、在实验室条件下从一个细胞或一种细将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养胞群繁殖得到的后代称为纯培养2、获得纯培养的技术、获得纯培养的技术1)稀释平皿分离法稀释平皿分离法2)平皿划线分离法平皿划线分离法3)单细胞挑取法单细胞挑取法1）pour plate method（稀释倒平板法）（稀释倒平板法）10-110-210-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-92)2)spread plate method（涂布（涂布平板法）平板法）3）streak plate method（平板划线分离法）平板划线分离法）3.单细胞挑取法接种针解剖镜.同步培养：同步
5、培养：是一种培养方法，它能使群体中不是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。群体细胞。同步生长：同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长方式称同一生长阶段，同时进行分裂的生长方式称为同步生长。为同步生长。同步细胞或同步培养物同步细胞或同步培养物：通过同步培养方法获：通过同步培养方法获得的细胞称得的细胞称。同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它一种理想的材料。特性
6、和作为工业发酵的种子，它一种理想的材料。二、微生物的个体生长和同步生长二、微生物的个体生长和同步生长 1、机械筛选方法、机械筛选方法（1）离心方法）离心方法（2）过滤分离法）过滤分离法（3）硝酸纤维素滤膜法）硝酸纤维素滤膜法2、环境条件控制技术、环境条件控制技术（1）温度）温度（2）培养基成分控制）培养基成分控制（3）其他）其他（1）离心方法）离心方法（2）过滤分离法）过滤分离法（3）硝酸纤维素滤膜法）硝酸纤维素滤膜法2、环境条件控制技术、环境条件控制技术（1）温度：）温度：通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。过培养可获得同步细胞。
7、（2）培养基成分控制：）培养基成分控制：将不同步的细菌在营养不足将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移至营养丰富的培养基中的条件下培养一段时间，然后转移至营养丰富的培养基中培养，能获得同步细胞。培养，能获得同步细胞。（3）其他：）其他：光照与黑暗交替培养获得光合细菌的同步细光照与黑暗交替培养获得光合细菌的同步细菌；加热杀死芽孢杆菌获得芽孢杆菌的同步细胞。菌；加热杀死芽孢杆菌获得芽孢杆菌的同步细胞。环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致胞内某些物质合成，它合成和积累可导致处理可能是导致胞内某些物质合成，它合成和积
8、累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。细胞分裂，从而获得同步细胞。三、单细胞微生物的典型生长曲线三、单细胞微生物的典型生长曲线将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。（一）（一）延滞期延滞期停滞期、调整期、适停滞期、调整期、适应期（应期（Lag phase）少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进少量细菌接种到新鲜培
9、养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。1 1、延滞期、延滞期出现原因出现原因2、延滞延滞的特点的特点3、影响、影响延滞延滞期限长短的因素期限长短的因素4 4、缩短、缩短延滞延滞期的意义及方法期的意义及方法A A、微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够的能量和必需的生长因子；的能量和必需的生长因子；B B、“种子种子
10、”老化（即处于非对数生长期）或老化（即处于非对数生长期）或未充分活化。未充分活化。C C、接种时造成的损伤接种时造成的损伤1 1、延滞期、延滞期出现原因出现原因2、延滞期延滞期的特点的特点特点：特点：1）生长速率常数为零；细菌数量不增加或增加很少。）生长速率常数为零；细菌数量不增加或增加很少。2）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状。）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状。3）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加的合成加速，易产生各种诱导酶。速，易产生各种诱导酶。4）对外界不良条件如对外界不良条件如NaCl溶液、温度和抗生素等理、溶液、温度和抗生
11、素等理、理化因素反应敏感。理化因素反应敏感。3、影响延滞期时间长短的因素B、接种龄:以对数期接种龄的种子接种，延滞期短以对数期接种龄的种子接种，延滞期短C、接种量:发酵工业上通常采用种子：发发酵工业上通常采用种子：发酵培养基酵培养基=1：10D、培养基成分:一般要求发酵培养基的成分一般要求发酵培养基的成分或种子培养基的成分尽量接近，且应适当丰富些。或种子培养基的成分尽量接近，且应适当丰富些。A、菌种特性4 4、缩短延滞期的意义及方法、缩短延滞期的意义及方法（1）意义：意义：可以缩短生产周期，提高设备利用率（2 2）缩短延滞期的方法）缩短延滞期的方法A、通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期 缩
12、短B、接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄C、尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相 差太大D、加大接种量（二）（二）Exponential phase（指数期）指数期）对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。1、特点、特点1）生长速率常数）生长速率常数R最大代时最短，生长最大代时最短，生长速度最快；速度最快；2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；物质按比例生长，菌体成分均匀；3）酶系活跃，代谢旺盛）酶系活跃，代谢旺盛。（2）三个重要参数：繁
13、殖代数，生长速率常数，代时A 繁殖代数（n）X2=X12n取对数表示生长速率常数：单位时间内繁殖的代数 代时（G）：每增殖一代所需的时间(三）三）Stationary phase(稳定期稳定期)1 1、出现原因、出现原因A A、营养的消耗营养的消耗C C、引起引起pHpH值值EHEH值的改变值的改变D D、有害代谢产物积累有害代谢产物积累对细菌生长不利导致本阶段出现对细菌生长不利导致本阶段出现B B、营养物的比例失调营养物的比例失调2、特点：、特点：1）生长常数为零，新生）生长常数为零，新生=死亡，达到动态死亡，达到动态平衡；活菌数的总量达到最大值；平衡；活菌数的总量达到最大值；2）胞内的储藏
14、物开始形成（如肝糖粒、胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；脂肪粒等）；3）某些芽孢菌的芽孢开始形成；某些芽孢菌的芽孢开始形成；4）某些细菌过量积累次级代谢产物，如某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。抗生素、维生素等。（四）四）Death phase(衰亡期衰亡期)特点：特点：1）细菌代谢活性降低；）细菌代谢活性降低；2）细菌衰老并出现自溶；）细菌衰老并出现自溶；3）产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶）产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。或抗生素等。4）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞
15、大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应四、连续培养四、连续培养是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续下微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续下去的一种培养方法。去的一种培养方法。基本原则：基本原则：在微生物培养过程中不断的补充营养在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。物质和以同样的速率移出培养物。连续发酵的优点：连续发酵的优点：1、高效、高效2、产品质量较稳定、产品质量较稳定3、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、节约了大量
16、动力、人力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。气、电的负荷均衡合理。缺点：缺点：1、菌种易退化、菌种易退化2、易污染杂菌、易污染杂菌3、营养物的利用率一般低于单批增大。、营养物的利用率一般低于单批增大。恒浊器：恒浊器：根据培养器内微生根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续度恒定的微生物细胞的连续培养器。培养器。恒化器：恒化器：与恒浊器相反，是与恒浊器相反，是一种设法使培养液流速保持一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养行生长繁殖的一种连续培养装置。装置。恒浊器与恒化器的比较装置装置控制对象控制对象培养基培养基 培养基培养基流速流速生长生长速率速率产物产物应用范围应用范围恒浊器恒浊器 菌体菌体密度密度（内控制）（内控制）无限制无限制生长因生长因子子不不恒定恒定 最高最高速率速率大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体相平行的相平行的代谢产物代谢产物生产为主生产为主恒化器恒化器 培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有有限制限制生长因生长因子子恒定恒定低于低于最高最高速率速率不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验室为实验室为主主