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1、水中大肠菌群的测定水中大肠菌群的测定一、目的要求一、目的要求 n1、掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法的原理、掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法的原理、操作步骤及方法；操作步骤及方法；n2、掌握划线分离法；、掌握划线分离法；n3、了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的、了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。重要性。二、基本原理二、基本原理 总大肠菌群指数高，表示水源被粪便污染，则有可总大肠菌群指数高，表示水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染。测定总大肠菌群的方法有多管发能也被肠道病原菌污染。测定总大肠菌群的方法有多管发酵法、滤膜法和各种各样的快速、简便的微生物检测
2、仪或酵法、滤膜法和各种各样的快速、简便的微生物检测仪或试剂纸（盒或卡）等。试剂纸（盒或卡）等。多管发酵法多管发酵法为我国大多数环保、卫为我国大多数环保、卫生和水厂等单位所采用，生和水厂等单位所采用，多管发酵法包括：初发酵试验、多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验。平板分离和复发酵试验。总大肠菌群（总大肠菌群（coliform group，total coliforms）是以是以E.coli为代表的杆状、无芽胞、需氧或兼性厌氧、革兰氏阴为代表的杆状、无芽胞、需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性，经性，经37、2448h培养，发酵乳糖产酸产培养，发酵乳糖产酸产CO2可区别于其他肠道可区别于其他肠
3、道菌，易于测定的一类细菌。大肠菌群主要包括埃希氏菌属、肠杆菌菌，易于测定的一类细菌。大肠菌群主要包括埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属。这类菌是温血动物肠道中的正属、克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属。这类菌是温血动物肠道中的正常菌群，常随动物的粪便污染水源，一个成年人每天排出的粪便中常菌群，常随动物的粪便污染水源，一个成年人每天排出的粪便中含有（含有（5-100）1010个这类细菌，并且个这类细菌，并且它们与水中存在的肠道病原它们与水中存在的肠道病原菌呈正相关性菌呈正相关性，而病原菌在水中的浓度很低，测定手续繁琐，工作，而病原菌在水中的浓度很低，测定手续繁琐，工作人员还有被感染传播的危
4、险。因此，总大肠菌群是一个合适的指示人员还有被感染传播的危险。因此，总大肠菌群是一个合适的指示菌，能指示出病原菌在水中的存在，其数量大于或等于病原菌的数菌，能指示出病原菌在水中的存在，其数量大于或等于病原菌的数量，并且比病原菌容易检出，所以检测水的细菌学卫生标准，通常量，并且比病原菌容易检出，所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测总大肠菌群。检测总大肠菌群。1 1、初发酵试验：、初发酵试验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳乳糖能起选择作用糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能，因为很多细菌不能发酵乳
5、糖，而大肠菌群能发酵乳发酵乳糖产酸产气糖产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作溴甲酚紫作为为pH指示剂指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还可移抑制其他细菌，如对芽胞菌生长的抑制。水样接种于发酵管紫还可移抑制其他细菌，如对芽胞菌生长的抑制。水样接种于发酵管内，内，37培养培养24h，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型的细菌说明水中存在大肠菌群，为阳性结果
6、。但是，有个别其他类型的细菌在此条件下可能产气，而不属于大肠菌群；此外，产酸不产气的发酵在此条件下可能产气，而不属于大肠菌群；此外，产酸不产气的发酵管，也不一定是非大肠菌群，因其在量少的情况下，也可能延迟管，也不一定是非大肠菌群，因其在量少的情况下，也可能延迟48h后后才产气，才产气，这两种情况应视为可疑结果这两种情况应视为可疑结果，因此，需要继续进行下面的实，因此，需要继续进行下面的实验，才能确定是否是大肠菌群。验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。后仍不产气的为阴性结果。2 2、平板分离：、平板分离：伊红美蓝琼脂平板含有伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此作为指伊红
7、和美蓝染料，在此作为指示剂示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的带核心的、有金属光泽的深紫色菌落深紫色菌落。初发酵管初发酵管24h内产酸产气和内产酸产气和48h产酸产气的均需在以产酸产气的均需在以上平板划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌上平板划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽胞杆菌只有染色为革兰氏阴性、无芽胞杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落的菌落，才是大肠菌群菌落。3 3、复发酵试验
8、：、复发酵试验：将以上两次试验已证实为大肠菌群阳性的菌落，接种将以上两次试验已证实为大肠菌群阳性的菌落，接种复发酵，其原理与初发酵试验相同，经复发酵，其原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌群存在的初发酵管（瓶）数目，查阅专用统计表，得出总群存在的初发酵管（瓶）数目，查阅专用统计表，得出总大肠菌群指数。大肠菌群指数。三、实验器材三、实验器材 n1、水样（自带）；、水样（自带）；n2、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基，
9、基，3倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基，伊红美蓝琼脂平板。基，伊红美蓝琼脂平板。n3、溶液和试剂：革兰氏染液、无菌水等。、溶液和试剂：革兰氏染液、无菌水等。n4、仪器和其他用品：显微镜、载玻片、无菌培养皿、灭、仪器和其他用品：显微镜、载玻片、无菌培养皿、灭菌吸管、灭菌试管、镊子、烧杯、温箱等。菌吸管、灭菌试管、镊子、烧杯、温箱等。四、操作步骤四、操作步骤水样的采取水样的采取 1）自来水自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开灭菌，再开放水龙头使水流放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以后，
10、以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。待分析。2 2）池水、河水或湖水池水、河水或湖水 应取距水面应取距水面1015cm的深层水样，的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。再从水中取出。最好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。1、初发酵试验：、初发酵试验：（自来水检查为例）自来水检查为例）在在2个含有个含有50mL 3倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各
11、加入各加入100mL水样。在水样。在10支含有支含有5mL3倍浓缩的乳糖蛋白胨倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵管中，各加入发酵管中，各加入10mL水样。混匀后，水样。混匀后，37培养培养24h，24h未产气的继续培养至未产气的继续培养至48h；2、平板分离：、平板分离：将将24h培养后产酸产气和培养后产酸产气和48h培养后产酸产气的发酵管，培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37下培养下培养1824h，将符合下列特征菌落：深紫黑色，有金属光泽；紫黑，将符合下列特征菌落：深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深
12、，挑取色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深，挑取其中的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检；其中的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检；3、复发酵试验：、复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽胞杆经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落型菌落13个，个，37培养培养24h，试验结果若产酸产气，即，试验结果若产酸产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管数查表发酵试验的阳性管数查表XIII-4，即得总大肠菌群。，即得总大肠菌群。五、实验报告五、实验报告 1、填表、填表2、查表得出大肠菌群数。（注明水样来源）、查表得出大肠菌群数。（注明水样来源）3、根据你的实验结果，水样是否合乎饮用标准？、根据你的实验结果，水样是否合乎饮用标准？