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1、关于分子荧光和磷光光谱第一页，本课件共有51页发光现象起因是吸收了外在提供的能量引起的外在的能量热电光化学能第二页，本课件共有51页荧光入射光入射光荧光荧光18521852年，年，StokesStokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其观察到其荧光的波长荧光的波长比比入射光的波长入射光的波长稍为稍为长些长些，才判明这种现象，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的他还由发荧光的矿物矿物“萤石萤石”推演而提出推演而提出“荧光荧光”这一术语这一术语.第三页，本课件共有51页萤
2、石纯净的萤石为无色，但因含有较多Y、Ce 等元素，造成萤石结构空位，产生色心而致色，常见的颜色有浅绿色至深绿色，蓝、绿蓝、黄、酒黄、紫、紫罗兰色、灰、褐、玫瑰红、深红等。第四页，本课件共有51页20012001年美国遭受年美国遭受911911袭击时，美国世贸大厦内一共有袭击时，美国世贸大厦内一共有2 2万万5 5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊叹的纪千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊叹的纪录：两座大楼里，录：两座大楼里，1 1万万8 8千多人在上百层的大楼完全断电千多人在上百层的大楼完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。的情况下，在一个半小时之内成功逃生。第五页，本课件共有
3、51页绿色荧光蛋白GFP绿色荧光蛋白第六页，本课件共有51页GFP第七页，本课件共有51页原理原理Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence第八页，本课件共有51页荧光和磷光的产生过程分子能级和跃迁电子能级、振动能级和转动能级基态（S0）激发态(S1、S2、激发态振动能级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第九页，本课件共有51页荧光和磷光的产生过程电子激发态的多重度单重态S三重态T大多数有机分子的基态处于单重态三重态能级比相应单重态能级
4、低 S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；第十页，本课件共有51页激发态基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；第十一页，本课件共有51页能级图S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能
5、量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫第十二页，本课件共有51页非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。第十三页，本课件共有51页辐射能量传递过程
6、荧光发射荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光；10-710-9 s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2 2 1；磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。第十四页，本课件共有51页激发光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光
7、波长的关系曲线（图中曲线I）激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；第十五页，本课件共有51页荧光（磷光）光谱固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。第十六页，本课件共有51页光谱例子第十七页，本课件共有51页激发光谱和发射光谱关系 StokesStokes位移位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的
8、最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2)。镜像规则镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。第十八页，本课件共有51页镜像规则 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基 态 上 的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。第十九页，本课件共有51页镜像规则200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱第二十页，本课件共有51页分子产生荧光的条件分子产生荧光必须具备的条件具有合适的结构（强的紫外可见吸收）具有一
9、定的荧光量子产率荧光量子产率（）荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射第二十一页，本课件共有51页化合物的结构和荧光（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。第二十二页，本课件共有51页荧光和取代基第二十三页，本课件共有51页长共轭结构共轭系统共轭系统 f ex、em 第二十四页，本课
10、件共有51页取代基供电子基：供电子基：NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN f，F吸电子基：吸电子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X f，F，甚至荧光熄灭甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+对对 f 无影响无影响 第二十五页，本课件共有51页影响荧光的外部效应1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；极性极性 fF 粘度粘度分子间碰撞几率分子间碰撞几率F含重原子含重原子(CBr4、CH3CH2I)F形成氢键形成氢键S1*(V=0)分子分子F第二十六页，本课件共有51页影响荧光的外部
11、效应2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；pH13 兰色荧光兰色荧光 第二十七页，本课件共有51页影响荧光的外部效应4.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自自吸吸现现象象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；第二十八页，本课件共有51页影响荧光的外部效应5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭:荧光物质浓度超过荧光物质浓度超过
12、1g/L时，增加荧光分子间碰时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。撞几率而产生的荧光熄灭现象。(浓度限量浓度限量1g 1mg/ml)荧荧光光熄熄灭灭剂剂(quenching medium)：引引起起荧荧光光熄熄灭灭的的物物质质。如如卤卤素素离离子子、重重金金属属离离子子、氧氧分分子子以以及及硝硝基基化化合合物物、重重氮氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。第二十九页，本课件共有51页仪器仪器Instruments第三十页，本课件共有51页仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光
13、源源、样样品品池池、双双单单色色器器系统、检测器。系统、检测器。特特殊殊点点：有有两两个个单单色色器器，光光源源与与检检测测器器通通常常成成直角。直角。第三十一页，本课件共有51页光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽强度；适用波长范围宽强度；适用波长范围宽强度；适用波长范围宽荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和荧光光度计中常
14、用高压汞灯和氙弧灯氙弧灯氙弧灯氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm、405 nm405 nm、436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源第三十二页，本课件共有51页同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；
15、如图。合适的合适的可可减少光谱重叠减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。第三十三页，本课件共有51页可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图第三十四页，本课件共有51页荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计光路光路光源光源仪器仪器校正校正吸收池吸收池入射光与吸收光入射光与吸收光同方向同方向入射光与荧光入射光与荧光垂直方向垂直方向两种光源两种光源(紫外紫外+可见可见)一种光源一种光源(紫外紫外)空白溶液空白溶液(F=
16、0)荧光对照品溶液荧光对照品溶液(F=100%或或50%)空白溶液空白溶液(T=100%)紫外无吸收紫外无吸收两面透光两面透光低荧光材料低荧光材料四面透光四面透光第三十五页，本课件共有51页荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。第三十六页，本课件共有51页定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度
17、 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c =Kc第三十七页，本课件共有51页定量依据与方法（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；第三十八页，本课件共有5
18、1页多组分混合物的荧光分析(1)(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测可直接测定定可分别在各自的可分别在各自的 荧荧波长处测定波长处测定,求出它们的含求出它们的含量量(2)(2)如果两组分的荧光峰相互干扰如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱但激发光谱有显著区别有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧在某一激发光下一个组分产生荧光峰光峰,另一组分不产生荧光另一组分不产生荧光;可选用不同的激发光进行测定可选用不同的激发光进行测定第三十九页，本课件共有51页多组分混合物的荧光分析激发光谱和发射光谱都互相干扰利用荧光强度的加和性（If=If1+If2+If3+），在
19、适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧例：硫胺荧 C CT T ex=385nm em=435nm 吡啶硫胺荧吡啶硫胺荧C CP P ex=410nm em=480nm相互干扰荧光光谱重叠在在385nm下激发下激发，在，在435和和480nm下分别测荧光强度下分别测荧光强度,或或410nm下激发下激发在在435和和480nm下分别测荧光强度下分别测荧光强度,第四十页，本课件共有51页n在在385nm下激发，下激发，在在435和和480nm下分别测荧光强度下分别测荧光强度If=KcK:纯物质在选定波长下测纯物质在选定波长下测If,求求K或或410 nm激发，激发，在在435和和480n
20、m下分别测荧光强度下分别测荧光强度If 435/385=26339 104cT+210 104cPIf 480/385=9685 104cT+1022 104cPIf 480/410=2816 104cT+1709 104cPIf 435/410=6419 104cT+252 104cP硫胺荧浓度硫胺荧浓度吡啶硫胺荧浓度吡啶硫胺荧浓度41第四十一页，本课件共有51页荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化
21、荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表 第四十二页，本课件共有51页第四十三页，本课件共有51页第四十四页，本课件共有51页有机化合物的分析脂肪族有机化合物脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。反应后才能进行荧光分析。芳香族化合物芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌
22、活性的多环芳烃有致癌活性的多环芳烃荧光分析法是最荧光分析法是最主要的测定方法。主要的测定方法。为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定。物与适当试剂反应之后进行测定。第四十五页，本课件共有51页维生素B2又称核黄素，是一种生长又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，菇和海藻中，VB2易溶于强酸易溶于强酸或强碱性溶液。或强碱性溶液。在低浓度情况下，在低浓度情况下，I=Kc，I与与c呈线性关系。呈线性关系。在在 ex光照射下，发出绿色光照
23、射下，发出绿色荧光，荧光，em=525 nm下测下测 I，用标准曲线法测定。，用标准曲线法测定。缺缺VB2会得口角炎、舌炎、会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎唇炎、脂溢性皮炎第四十六页，本课件共有51页3，4 苯并芘的测定3，4 苯并芘为强致癌物质苯并芘为强致癌物质n n煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生垃圾都会产生垃圾都会产生垃圾都会产生3 3，4 苯并芘，汽车尾气也是主要来源。苯并芘，汽车尾气也是主要来源。n n食品加工过
24、程也会产生食品加工过程也会产生食品加工过程也会产生食品加工过程也会产生3 3，4 4 苯并芘，尤其是烟熏、苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品。油炸、烘烤食品。n n分析测定：用环己烷将分析测定：用环己烷将分析测定：用环己烷将分析测定：用环己烷将3 3，4 苯并芘从试样中提取出苯并芘从试样中提取出苯并芘从试样中提取出苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用离纯化，用离纯化，用离纯化，用95%C95%C2 2H H5
25、5OH稀释，用荧光分光光度计测定相稀释，用荧光分光光度计测定相稀释，用荧光分光光度计测定相稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量。对荧光强度进行定量。对荧光强度进行定量。对荧光强度进行定量。第四十七页，本课件共有51页三、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见表第四十八页，本课件共有51页第四十九页，本课件共有51页第五十页，本课件共有51页感感谢谢大大家家观观看看2022/12/8第五十一页，本课件共有51页