《分子生物学常用实验技术概述精选课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学常用实验技术概述精选课件.ppt（29页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、关于分子生物学常用实验技术概述第一页，本课件共有29页分子杂交技术分子杂交技术利用单链核苷酸碱基互补配对；抗原与抗体、受体与利用单链核苷酸碱基互补配对；抗原与抗体、受体与利用单链核苷酸碱基互补配对；抗原与抗体、受体与利用单链核苷酸碱基互补配对；抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测，广泛用于基因重组、生物印迹示踪、生物白质检测，广泛用于基因重组、生物印迹示踪、生物白质检测，广泛用于基因重组、生物印迹示踪、生物白质检测，广泛用
2、于基因重组、生物印迹示踪、生物芯片等领域，具有高特异性、高灵敏度、高通量等特芯片等领域，具有高特异性、高灵敏度、高通量等特芯片等领域，具有高特异性、高灵敏度、高通量等特芯片等领域，具有高特异性、高灵敏度、高通量等特点的技术。点的技术。点的技术。点的技术。第二页，本课件共有29页核酸杂交核酸杂交(nucleic acid hybridization)DNADNA的变性的变性的变性的变性(Denaturation)(Denaturation)：维持双螺旋稳定性的：维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂，氢键和疏水键的断裂，DNADNA分子由稳定的双螺旋分子由稳定的双螺旋分子由稳定的双螺旋分子由稳定的
3、双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象结构松解为无规则线性结构的现象结构松解为无规则线性结构的现象结构松解为无规则线性结构的现象复性复性复性复性：变性：变性：变性：变性DNA DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部在适当条件下，二条互补链全部或部在适当条件下，二条互补链全部或部在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。分恢复到天然双螺旋结构的现象。分恢复到天然双螺旋结构的现象。分恢复到天然双螺旋结构的现象。核酸分子杂交核酸分子杂交：指具有一定互补序列不同来源的两：指具有一定互补序列不同来源的两：指具有一定互补序列不同来源的两：指具有一定互补序列不同来源的两条核酸单链（条核酸
4、单链（条核酸单链（条核酸单链（DNADNA或或或或RNARNA），在一定条件下按碱基互），在一定条件下按碱基互），在一定条件下按碱基互），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异源双链的过程补配对原则经过退火处理，形成异源双链的过程补配对原则经过退火处理，形成异源双链的过程补配对原则经过退火处理，形成异源双链的过程 。第三页，本课件共有29页核酸杂交核酸杂交核酸杂交探针核酸杂交探针核酸杂交探针核酸杂交探针(probe)(probe)：能够与靶分子核酸按碱基互补原：能够与靶分子核酸按碱基互补原：能够与靶分子核酸按碱基互补原：能够与靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡
5、核苷酸或核酸。则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。Southern blot:通过限制性核酸内切酶降解样本中通过限制性核酸内切酶降解样本中DNADNA，再经凝胶电泳分离、转印到固相支持物上，再经凝胶电泳分离、转印到固相支持物上，用探针（用探针（DNA/DNADNA/DNA杂交）进行检测的方法杂交）进行检测的方法杂交）进行检测的方法杂交）进行检测的方法 。用于基。用于基。用于基。用于基因组因组因组因组DNADNA特异性序列定位、检测目标特异性序列定位、检测目标DNADNA。Northern
6、 blot:Northern blot:应用应用应用应用DNADNA探针检测特异探针检测特异探针检测特异探针检测特异mRNAmRNA的一种杂交的一种杂交的一种杂交的一种杂交技术。用于研究特异性技术。用于研究特异性技术。用于研究特异性技术。用于研究特异性mRNAmRNA分子在细胞处于不同条件下分子在细胞处于不同条件下分子在细胞处于不同条件下分子在细胞处于不同条件下发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。第四页，本课件共有29页Southe
7、rn blot第五页，本课件共有29页蛋白质印迹蛋白质印迹-Western blot将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测方法质检测方法质检测方法质检测方法将获得的蛋白质样品通过将获得的蛋白质样品通过将获得的蛋白质样品通过将获得的蛋白质样品通过SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)，对不同分子量的蛋白质进行分离，再将，对不同分子量的蛋白质进行分离，再将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支
8、持物（凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NCNC膜或膜或PVDF PVDF 膜）上，用特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋膜）上，用特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋膜）上，用特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋膜）上，用特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋白进行特异性结合，再加入与一抗特异性结合带有标白进行特异性结合，再加入与一抗特异性结合带有标白进行特异性结合，再加入与一抗特异性结合带有标白进行特异性结合，再加入与一抗特异性结合带有标记的二抗记的二抗记的二抗记的二抗(HRP/AP)(HRP/AP)，经过底物显色或放射自显影，检，经过底物显色或放射自显影，检，经过底物显色或放射自显影，检，经过底物显色或放射自
9、显影，检测被检生物样本中目的基因蛋白表达情况测被检生物样本中目的基因蛋白表达情况测被检生物样本中目的基因蛋白表达情况测被检生物样本中目的基因蛋白表达情况 第六页，本课件共有29页Western blot第七页，本课件共有29页三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较第八页，本课件共有29页原位杂交原位杂交(in situ hybridization,ISH)将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确片中核酸进行杂交，从而对
10、特定核酸顺序进行精确片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。定量定位的过程。定量定位的过程。定量定位的过程。为研究单一细胞中为研究单一细胞中DNADNA和编码各种蛋白质、多肽的和编码各种蛋白质、多肽的和编码各种蛋白质、多肽的和编码各种蛋白质、多肽的相应相应相应相应mRNAmRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细的定位提供了手段，使从分子水平研究细的定位提供了手段，使从分子水平研究细的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具胞内基因表达及有关基因调控提
11、供了有效的工具胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具 。第九页，本课件共有29页菌落原位杂交与荧光原位杂交菌落原位杂交与荧光原位杂交(FISH)第十页，本课件共有29页生物芯片生物芯片(biochip)将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载以预先设计的方式有序地、高密度
12、地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子列阵，与待测生物样本靶分子杂交，通体上，构成二维分子列阵，与待测生物样本靶分子杂交，通体上，构成二维分子列阵，与待测生物样本靶分子杂交，通体上，构成二维分子列阵，与待测生物样本靶分子杂交，通过检测信号实现快速、高效、高通量样本检测。过检测信号实现快速、高效、高通量样本检测。过检测信号实现快速、高效、高通量样本检测。过检测信号实现快速、高效、高通量样本检测。第十一页，本课件共有29页微列阵芯片微列阵芯片(microarray chip)基因芯片基因芯片(DNA microarray)(DNA microarray)：将：将：将：将cDNA或寡核苷酸按或寡核
13、苷酸按或寡核苷酸按或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上，以此为探针与待测微阵列方式固定在微型载体上，以此为探针与待测微阵列方式固定在微型载体上，以此为探针与待测微阵列方式固定在微型载体上，以此为探针与待测样品中基因杂交，通过检测杂交信号的强度及分布样品中基因杂交，通过检测杂交信号的强度及分布样品中基因杂交，通过检测杂交信号的强度及分布样品中基因杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来实现对靶序列信息的快速检测和分析。来实现对靶序列信息的快速检测和分析。来实现对靶序列信息的快速检测和分析。来实现对靶序列信息的快速检测和分析。蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein microarr
14、ay)：将已知的多肽、：将已知的多肽、蛋白质按微阵列方式固定在微型载体上，利用抗蛋白质按微阵列方式固定在微型载体上，利用抗原与抗体、受体与配体、酶与底物、蛋白与其他原与抗体、受体与配体、酶与底物、蛋白与其他小分子间相互作用，检测分析多肽、蛋白质的一小分子间相互作用，检测分析多肽、蛋白质的一项技术。项技术。第十二页，本课件共有29页微列阵芯片微列阵芯片(microarray chip)细胞芯片：在芯片上完成对细胞的捕获、细胞芯片：在芯片上完成对细胞的捕获、细胞芯片：在芯片上完成对细胞的捕获、细胞芯片：在芯片上完成对细胞的捕获、固定、固定、固定、固定、平平平平衡、衡、衡、衡、运输、运输、运输、运输
15、、刺激及培养等精确控制，并通过微型化刺激及培养等精确控制，并通过微型化刺激及培养等精确控制，并通过微型化刺激及培养等精确控制，并通过微型化的化学分析方法，的化学分析方法，的化学分析方法，的化学分析方法，实现对细胞样品的高通量、实现对细胞样品的高通量、实现对细胞样品的高通量、实现对细胞样品的高通量、多参多参多参多参数、数、数、数、连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研究目的。究目的。究目的。究目的。组织芯片：将不同生物体的组织按预先设计或研究需要组织芯片：将不同生物体的组织按
16、预先设计或研究需要组织芯片：将不同生物体的组织按预先设计或研究需要组织芯片：将不同生物体的组织按预先设计或研究需要排列在固相载体山所形成的组织微列阵。排列在固相载体山所形成的组织微列阵。排列在固相载体山所形成的组织微列阵。排列在固相载体山所形成的组织微列阵。第十三页，本课件共有29页基因芯片基因芯片第十四页，本课件共有29页目的基因制备技术目的基因制备技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)：在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或在体外由引物
17、介导的、酶促快速合成扩增特定基因或DNA片段的一种方法。片段的一种方法。片段的一种方法。片段的一种方法。cDNAcDNA文库文库文库文库(cDNA library):(cDNA library):某一生物特定器官或特定发某一生物特定器官或特定发某一生物特定器官或特定发某一生物特定器官或特定发育阶段的细胞内总育阶段的细胞内总育阶段的细胞内总育阶段的细胞内总mRNA，应用逆转录酶逆转录成，应用逆转录酶逆转录成，应用逆转录酶逆转录成，应用逆转录酶逆转录成cDNA，以此构建的重组，以此构建的重组，以此构建的重组，以此构建的重组DNADNA克隆群。克隆群。克隆群。克隆群。化学合成：化学合成：化学合成：化
18、学合成：序列已知的较短目的基因序列已知的较短目的基因序列已知的较短目的基因序列已知的较短目的基因第十五页，本课件共有29页聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)1.1.原理原理原理原理：以拟扩增的：以拟扩增的：以拟扩增的：以拟扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与模板互分子为模板，以一对分别与模板互分子为模板，以一对分别与模板互分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在补的寡核苷酸片段为引物，在补的寡核苷酸片段为引物，在补的寡核苷酸片段为引物，在DNADNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPsdNTPs为底物，按照半保留复制原理，通过变性
19、、退火、为底物，按照半保留复制原理，通过变性、退火、为底物，按照半保留复制原理，通过变性、退火、为底物，按照半保留复制原理，通过变性、退火、延伸三个步骤不断重复完成新延伸三个步骤不断重复完成新延伸三个步骤不断重复完成新延伸三个步骤不断重复完成新DNADNA合成。合成。合成。合成。2.PCRPCR体系的基本成分体系的基本成分体系的基本成分体系的基本成分：模板、特异性引物、热稳定的：模板、特异性引物、热稳定的DNADNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸聚合酶、脱氧核苷三磷酸聚合酶、脱氧核苷三磷酸聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)(dNTP)、二价阳离子、二价阳离子(Mg2+)(Mg2+)、缓冲液、一价阳离子
20、、缓冲液、一价阳离子、缓冲液、一价阳离子、缓冲液、一价阳离子第十六页，本课件共有29页PCR的基本步骤的基本步骤1.变性：变性：变性：变性：双链双链双链双链DNADNA解离成为单链解离成为单链解离成为单链解离成为单链(94(94)2.2.退火退火退火退火(复性复性复性复性)：引物与模板引物与模板引物与模板引物与模板DNA单链的互补序列配单链的互补序列配对结合（对结合（50 50 左右）左右）3.3.延伸延伸延伸延伸：DNA模板模板模板模板-引物结合物在引物结合物在引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作聚合酶的作聚合酶的作用下，以用下，以用下，以用下，以dNTPdN
21、TP为反应原料，靶序列为模板，按碱基为反应原料，靶序列为模板，按碱基为反应原料，靶序列为模板，按碱基为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的互补链配对原则，合成一条新的互补链配对原则，合成一条新的互补链配对原则，合成一条新的互补链 （70 70 左右）左右）左右）左右）第十七页，本课件共有29页PCR的应用的应用1.1.研究研究研究研究目的基因的扩增、基因克隆；目的基因的扩增、基因克隆；目的基因的扩增、基因克隆；目的基因的扩增、基因克隆；DNADNA测序；测序；测序；测序；基因功能和表达调控的研究、分析突变基因功能和表达调控的研究、分析突变基因功能和表达调控的研究、分析突变基因功
22、能和表达调控的研究、分析突变2.诊断诊断诊断诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断3.3.人类基因组工程人类基因组工程人类基因组工程人类基因组工程遗传图谱的构建；遗传图谱的构建；遗传图谱的构建；遗传图谱的构建；DNA测测测测序；表达图谱序；表达图谱序；表达图谱序；表达图谱4.4.法医法医法医法医犯罪现场标本分析、亲子鉴定犯罪现场标本分析、亲子鉴定犯罪现场标本分析、亲子鉴定犯罪现场标本分析、亲子鉴定5.肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤各种肿瘤检测各种肿瘤检测6.6.其他其他其他其他第十八页，本课件共有29页cDNA文库文库基本原理：基
23、本原理：基本原理：基本原理：用用Oligo(dT)Oligo(dT)作为逆转录引物，或使用随机引作为逆转录引物，或使用随机引作为逆转录引物，或使用随机引作为逆转录引物，或使用随机引物，以提取的总物，以提取的总物，以提取的总物，以提取的总mRNA为模板，进行逆转录为模板，进行逆转录为模板，进行逆转录为模板，进行逆转录PCRPCR，合成，合成，合成，合成的的的的cDNAcDNA连接到适当的载体，转化后获得包含连接到适当的载体，转化后获得包含cDNAcDNA的克隆群。的克隆群。基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤：(1)(1)提纯获取高质量的提纯获取高质量的提纯获取高质量的提纯获取高质量的mRNA;(2
24、)cDNAmRNA;(2)cDNA第一第一第一第一条链的合成条链的合成条链的合成条链的合成;(3)cDNA;(3)cDNA第二条链的合成第二条链的合成第二条链的合成第二条链的合成;(4);(4)双链双链双链双链cDNAcDNA的的修饰修饰;(5);(5)双链双链双链双链cDNA的分子克隆的分子克隆的分子克隆的分子克隆;(6)cDNA;(6)cDNA文库的扩增文库的扩增文库的扩增文库的扩增;(7)cDNA文库鉴定评价。文库鉴定评价。文库鉴定评价。文库鉴定评价。第十九页，本课件共有29页第二十页，本课件共有29页cDNA文库的优越性文库的优越性在基因组水平上研究某基因对器官组织和细胞在个在基因组水
25、平上研究某基因对器官组织和细胞在个在基因组水平上研究某基因对器官组织和细胞在个在基因组水平上研究某基因对器官组织和细胞在个体发育中的影响体发育中的影响体发育中的影响体发育中的影响cDNA文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊组织基因的制备组织基因的制备组织基因的制备组织基因的制备由于每一个由于每一个由于每一个由于每一个cDNA克隆都包含一种克隆都包含一种克隆都包含一种克隆都包含一种mRNA序列，在序列，在筛选中出现假阳性的概率降低筛选中出现假阳性的概率降低为了测定为
26、了测定为了测定为了测定mRNAmRNA序列，利用它的序列，利用它的序列，利用它的序列，利用它的cDNAcDNA拷贝序列就可拷贝序列就可以有效分析外显子的基因结构以有效分析外显子的基因结构第二十一页，本课件共有29页化学合成化学合成作为核酸分子杂交探针作为核酸分子杂交探针作为核酸分子杂交探针作为核酸分子杂交探针作为测序及作为测序及作为测序及作为测序及PCRPCR的引物的引物的引物的引物制备较小的基因或天然来源不易得到的完整基因或用于制备较小的基因或天然来源不易得到的完整基因或用于制备较小的基因或天然来源不易得到的完整基因或用于制备较小的基因或天然来源不易得到的完整基因或用于改造天然基因改造天然基
27、因改造天然基因改造天然基因作为作为作为作为DNADNA末端改造中的接头、引入酶切位点末端改造中的接头、引入酶切位点用于基因定位及位点专一性改变用于基因定位及位点专一性改变用于基因定位及位点专一性改变用于基因定位及位点专一性改变第二十二页，本课件共有29页基因敲除技术基因敲除技术(Gene knockout)外源外源外源外源DNADNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同同源重组，从而代
28、替受体细胞基因组中的相同同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基相似的基相似的基相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。因序列，整合入受体细胞的基因组中。因序列，整合入受体细胞的基因组中。因序列，整合入受体细胞的基因组中。原理与基本操作原理与基本操作:(1)ESCs(embryo stem cells)的获得的获得;(2)基因载体的构建基因载体的构建基因载体的构建基因载体的构建;(3);(3)目的基因导入目的基因导入目的基因导入目的基因导入;(4);(4)同源重组同源重组同源重组同源重组ESCESC的的的的筛选筛选筛选筛选;(5)靶细胞导入小鼠体内靶细胞导入小鼠体内靶细胞导入小鼠体
29、内靶细胞导入小鼠体内;(6);(6)表型研究表型研究表型研究表型研究;(7);(7)得到纯合得到纯合得到纯合得到纯合体体体体第二十三页，本课件共有29页基因敲除小鼠的产生原理基因敲除小鼠的产生原理第二十四页，本课件共有29页RNA干扰技术干扰技术RANRAN干扰干扰干扰干扰(RNA interference,RNAi):(RNA interference,RNAi):外源和内源性外源和内源性外源和内源性外源和内源性双链双链双链双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)RNA(double-strand RNA,dsRNA)在生物体内在生物体内在生物体内在生物体内诱导同源靶基因
30、的诱导同源靶基因的诱导同源靶基因的诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后特异性降解，导致转录后基因沉默的技术。基因沉默的技术。RNAiRNAi的作用机制的作用机制的作用机制的作用机制:1.1.RNARNA诱导的诱导的DNADNA甲基化：甲基化：甲基化：甲基化：RNARNA被降解为被降解为被降解为被降解为21-23nt小片小片小片小片段，特异性诱导同源序列段，特异性诱导同源序列段，特异性诱导同源序列段，特异性诱导同源序列DNADNA甲基化。甲基化。甲基化。甲基化。2.2.dsRNAdsRNA诱导的诱导的RNAiRNAi作用。作用。作用。作用。第二十五页，本课件共有29页dsRNA诱导的诱
31、导的RNAi作用机制作用机制1.1.起始阶段：起始阶段：起始阶段：起始阶段：dsRNAdsRNA被被被被DicerDicer加工裂解为加工裂解为加工裂解为加工裂解为21-23nt21-23nt的的的的siRNAsiRNA2.2.效应阶段：效应阶段：效应阶段：效应阶段：siRNAsiRNA与解与解与解与解旋酶、旋酶、旋酶、旋酶、ATPATP、多种蛋白、多种蛋白、多种蛋白、多种蛋白质形成质形成质形成质形成RISCRISC，结合并，结合并，结合并，结合并切割靶切割靶切割靶切割靶mRNAmRNA第二十六页，本课件共有29页RNAi的作用特点的作用特点1.1.高度特异性高度特异性高度特异性高度特异性2.
32、2.高效性高效性高效性高效性3.3.受多基因控制受多基因控制4.4.需要需要需要需要siRNAsiRNA介导介导5.5.对靶基因位点具有选择性对靶基因位点具有选择性对靶基因位点具有选择性对靶基因位点具有选择性6.6.具有放大效应具有放大效应具有放大效应具有放大效应第二十七页，本课件共有29页siRNA的设计与制备的设计与制备设计原则设计原则设计原则设计原则:(1):(1)从转录本（从转录本（从转录本（从转录本（mRNAmRNA）的）的）的）的AUGAUG起始密码开始，寻找起始密码开始，寻找起始密码开始，寻找起始密码开始，寻找“AA”AA”二连序列，并记下其二连序列，并记下其二连序列，并记下其二
33、连序列，并记下其3 3端的端的端的端的1919个碱基序列，作为潜在个碱基序列，作为潜在个碱基序列，作为潜在个碱基序列，作为潜在的的的的siRNAsiRNA靶位点靶位点靶位点靶位点;(2);(2)尽量避免尽量避免尽量避免尽量避免5 5和和和和3 3端的非编码区；端的非编码区；端的非编码区；端的非编码区；(3)siRNA(3)siRNA序序序序列的列的列的列的GCGC含量应为含量应为含量应为含量应为30%-50%30%-50%左右左右左右左右;(4);(4)将挑选的序列在公共数据库将挑选的序列在公共数据库将挑选的序列在公共数据库将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
34、中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。siRNAsiRNA制备：化学合成、体外转录、制备：化学合成、体外转录、制备：化学合成、体外转录、制备：化学合成、体外转录、RNaseIIIRNaseIII消化长片段消化长片段消化长片段消化长片段dsRNAdsRNA制备制备制备制备siRNAsiRNA、siRNAsiRNA表达载体表达载体表达载体表达载体(short hairpin RNA,shRNA)(short hairpin RNA,shRNA)、siRNAsiRNA表达框表达框表达框表达框第二十八页，本课件共有29页感感谢谢大大家家观观看看12/8/2022第二十九页，本课件共有29页