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1、关于酶工程 抗体酶、核酶和极端酶第一页，本课件共有61页第一节第一节 抗体酶（抗体酶（Abzyme)Abzyme)一、抗体酶的理论基础一、抗体酶的理论基础1.1.抗体蛋白的特性：抗体蛋白的特性：2.2.抗体（抗体（antibodyantibody）：）：3.3.抗原（抗原（antigenantigen）：）：4.4.半抗原（半抗原（haptenhapten）：）：第二页，本课件共有61页第三页，本课件共有61页IgG的三级结构的三级结构第四页，本课件共有61页IgGIgG与抗原形成与抗原形成 的交联晶格的交联晶格第五页，本课件共有61页抗体与酶的异同：抗体与酶的异同：相同点：相同点：都是蛋白质
2、，都有特异性。都是蛋白质，都有特异性。不同点：不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。质。第六页，本课件共有61页3）酶的活性和合成受到代谢调节，种）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。无限。第七页，本课件共有61页2.2.酶与底物形成过渡态理论酶与底物形成过渡态理论 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，酶的催化在于能结合底物产生过
3、渡态，降低能障（反应的活化能）。降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。第八页，本课件共有61页二、抗体酶的定义二、抗体酶的定义 抗体酶又称催化抗体（抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），是抗体的高度选择性和酶），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变
4、区赋予了酶的属性。在其可变区赋予了酶的属性。第九页，本课件共有61页 三、抗体酶的制备三、抗体酶的制备 1.诱导法诱导法 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。第十页，本课件共有61页第十一页，本课件共有61页2.拷贝法拷贝法 用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再
5、将此抗体免疫动物并进行单克隆化，体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶新酶.第十二页，本课件共有61页第十三页，本课件共有61页3 引入法引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术第十四页，本课件共有61页引入法举例引入法举例第十五页，本课件共有61页四、抗体酶的应用四、抗体酶的应用 1.1.戒毒戒毒:用可
6、卡因水解的过渡态类似物用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。第十六页，本课件共有61页 2.肿瘤治疗肿瘤治疗 抗体介导前药治疗技术抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶后，当药物扩散
7、至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。第十七页，本课件共有61页抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应1酰基转移反应酰基转移反应第十八页，本课件共有61页2重排反应重排反应第十九页，本课件共有61页3氧化还原反应氧化还原反应第二十页，本课件共有61页5磷酸酯水解反应磷酸酯水解反应第二十一页，本课件共有61页6磷酸酯闭环反应磷酸酯闭环反应第二十二页，本课件共有61页7.光诱导反应光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）第二十三页，本课件共有61页b.光裂解反应光裂解反应第二十四页，本课件共有61页研究展望1 研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系
8、的一般规律。2 获得一类新型的蛋白酶。3 催化天然酶不能催化的反应。第二十五页，本课件共有61页第二节 核 酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素第二十六页，本课件共有61页ribozymeribozyme的发现的发现80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学的和美国耶鲁大学的Sidnery Altman各自独立地发现各自独立地发现RNA具有生物催化功能具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，为此，T.Cec
9、h和和S.Altman共同获得了共同获得了1989年年度诺贝尔化学奖。度诺贝尔化学奖。第二十七页，本课件共有61页 具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：模拟酶其它：模拟酶核酸类核酸类:克隆酶克隆酶遗传修饰酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme第二十八页，本课件共有61页 I型内含子剪接型核酶 II型内含子 锤头核酶剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（H
10、DV)核酶 RNaseP 异体催化 二、核酶的分类第二十九页，本课件共有61页 自然界存在催化分子内反应（in cis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(in trans)的ribozyme。第三十页，本课件共有61页自我剪接ribozyme分类自我剪接ribozyme可分为两类：型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5鸟苷酸）和Mg2+参与。型IVS：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+第三十一页，本课件共有61页2自我剪切ribozyme的分类自我
11、剪切ribozyme,自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。第三十二页，本课件共有61页几种能进行自我剪切的几种能进行自我剪切的RNARNA结构结构第三十三页，本课件共有61页催化分子间反应的ribozyme的分类如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。第三十四页，本课件共有61页第三十五页，本课件共有61页1.1.剪接型核酶剪接型核酶 剪接型核酶的作用机制是通过既剪又剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（接的方式除去内含子（Intron)Intron)。第三十六页，本课件共有61页
12、1 1）I I类内含子的自我剪接类内含子的自我剪接(Self-splicing)(Self-splicing)I I型型IVSIVS是与四膜虫是与四膜虫26srRNA26srRNA前体的前体的IVSIVS结构结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA26srRNA及及G-IVSG-IVS，G-IVSG-IVS经两次环化生成经两次环化生成L-19IVSL-19IVS。催化过。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。剪接机制剪接机制L-19IVSL-19IVS在体外的多种酶
13、活性在体外的多种酶活性第三十七页，本课件共有61页p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)5第三十八页，本课件共有61页 第三十九页，本课件共有61页UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜虫rRNA前体自我剪接反应第四十页，本课件共有61页第四十一页，本课件共有61页
14、1、转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC+pC3、转磷酸作用转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 第四十二页，本课件共有61页2 2）类内含子的自我剪接类内含子的自我剪接型型IVSIVS是与细胞核是与细胞核mRNAmRNA前体的前体的IVSIVS结构结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反
15、应，相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的生成成熟的RNARNA及套环状的及套环状的IVSIVS。催化的。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子仍需要镁离子(Mg(Mg2+2+)。剪接机制剪接机制第四十三页，本课件共有61页p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外显子连接第四十四页，本课件共有61页2.2.剪切型核酶剪切型核酶 这类这类RNARNA进行自身催化的反应是只切不接。进行自身催化的反应是只切不接。1 1）自体催化剪切型）自体催化剪切型 剪切机制剪切机制 第
16、四十五页，本课件共有61页转酯化过程：转酯化过程：由靠近切割位由靠近切割位点点33端的端的2OH2OH或或氧原子对切割位点氧原子对切割位点的磷原子实施亲核的磷原子实施亲核攻击，产生攻击，产生5-OH 5-OH 和和22，3-3-环磷环磷酸二酯酸二酯。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应第四十六页，本课件共有61页锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区。三个双螺旋区。1313个核苷酸残基个核苷酸残基保守序列。保守序列。剪切反应在右上剪切反应在右上方方GUXGUX序列的序列的33端端自动发生。自动发生。第四十七页，本课件共有61页发夹（发夹（hairpin hai
17、rpin）结构）结构19891989年汉普（年汉普（HampleHample）研究烟草环斑病毒）研究烟草环斑病毒（sTRSVsTRSV）的负链）的负链RNARNA的自我剪切反应，提的自我剪切反应，提出发夹结构（出发夹结构（hairpin structurehairpin structure）模型。）模型。发夹核酶结构模型发夹核酶结构模型第四十八页，本课件共有61页四个螺旋区、三个连四个螺旋区、三个连接区和两个环。接区和两个环。剪切反应发生在底剪切反应发生在底物识别序列物识别序列GUCGUC的的55端。端。53 发夹二级结构模型剪切位点第四十九页，本课件共有61页2)2)异体催化剪切型异体催化剪
18、切型 核糖核酸酶核糖核酸酶P(RNaseP)P(RNaseP)是内切核酸酶，是核是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNAtRNA前体的前体的5 5端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成3-OH 3-OH 和和 5-5-磷酸末端。磷酸末端。l RNasePRNaseP由由M1RNAM1RNA和蛋白质亚基组成。和蛋白质亚基组成。第五十页，本课件共有61页三、核酶的应用三、核酶的应用1.1.基础理论：生命起源的探索基础理论：生命起源的探索2.2.医药：医药：1 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，
19、抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒型（型（HIV-)HIV-)、抗肿瘤。、抗肿瘤。2 2）免疫原性低，很少引起免疫反应。）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.3.植物抗病毒植物抗病毒第五十一页，本课件共有61页 四、核酶面临的问题四、核酶面临的问题1 1、核酶催化效率低。、核酶催化效率低。2 2、核酶本身是、核酶本身是RNARNA，很容易被核酸水解酶，很容易被核酸水解酶 RNaseRNase破坏。破坏。第五十二页，本课件共有61页五、影响核酶活性的因素五、影响核酶活性的因素1 1、pHpH值对活性的影响：值对活性的影响：pH7.
20、0-7.5pH7.0-7.5时核酶活性最高。时核酶活性最高。2 2、二价金属阳离子对活性的影响、二价金属阳离子对活性的影响:Mg:Mg2+2+Mn Mn2+2+3 3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应4 4、变性剂对活性的影响、变性剂对活性的影响:5 5、温度对活性的影响、温度对活性的影响:第五十三页，本课件共有61页Ribozyme研究进展与展望对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme 第五十四页，本课件共有61页研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ri
21、bozyme设计出催化分子间反应的ribozyme.第五十五页，本课件共有61页Ribozyme的固定化Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。意义：对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA为底物的ribozyme第五十六页，本课件共有61页第三节 极端酶（extremozyme）一、极端微生物和极端酶一、极端微生物和极端酶 1.1.极端微生物：极端微生物：又称嗜极菌（又称嗜极菌（extremophilesextremophiles），是在超），是在超常
22、生态环境条件下生存的微生物。常生态环境条件下生存的微生物。第五十七页，本课件共有61页 根据所耐受的环境条件不同，分为：根据所耐受的环境条件不同，分为：嗜热菌（嗜热菌（thermophiles）超嗜热菌（超嗜热菌（hyperthermophiles）嗜冷菌（嗜冷菌（psychrophiles）嗜盐菌（嗜盐菌（halophiles）嗜酸菌（嗜酸菌（acidophiles）嗜碱菌嗜碱菌（alkaliphiles）嗜压菌（嗜压菌（barophiles）抗辐射的微生物抗辐射的微生物第五十八页，本课件共有61页2.2.极端酶的制备极端酶的制备 1 1）天然极端酶的筛选和生产）天然极端酶的筛选和生产 2 2）蛋白质工程生产极端酶）蛋白质工程生产极端酶第五十九页，本课件共有61页思考题：思考题：第六十页，本课件共有61页感谢大家观看第六十一页，本课件共有61页