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1、色谱分析ChromatographicAnalysis浙江大学化学系浙江大学化学系 色谱分析方法12/7/20222色谱分析-1色谱分离方法：12/7/20223色谱分析-1色谱法是一种分离方法，它利用被分离的诸物质在互不相溶互不相溶的两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相作相对移动相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复反复多多次分配次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。12/7/20224色谱分析-1色谱分析技术有广泛的应用领域色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油
2、化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。12/7/20225色谱分析-1石油化工石油产品质量监控油田开发（吸附丝技术）12/7/20226色谱分析-1环保污水检测大气检测(室内和环境中空气质量监测、汽车内空气质量监测)12/7/20227色谱分析-1医药卫生提纯净化提纯净化如手性色谱分离有效成分药物中间体的处理药物中间体的处理食品卫生监测食品卫生监测（瘦肉精、农残、抗生素）12/7/20228色谱分析-1化学研究样品提纯如合成产品的检验等物质性质与其配比的相关性色谱法和化学计量学方法结合12/7/20229色谱分析-
3、1生命科学研究DNA测序用CE、HPLC技术、生物工程下游技术细胞的培养、分离、纯化和分析检测参见刘国诠主编生物工程下游技术化学工业出版社，1993年12/7/202210色谱分析-1一、方法的发展1952年，Martin和Synge首次用气体为流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱法。1953年，Adams和Holmes合成了离子交换剂，并将其用于色谱分离，从而形成了离子交换色谱法。1958年，Golay提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法12/7/202211色谱分析-1一、方法的发展1938年，Izmailov等将糊状氧化铝铺展在玻璃板上，形成2mm厚的薄层，用于分离药用植物的萃取物
4、，开始了薄层色谱法。1944年，Consden、Cordon和Martin创立了纸色谱法。他们利用滤纸的毛细作用，让溶剂由下至上地渗透，结合混合物中各组分在两相中的溶解度的差异，使各组分以不同速率在滤纸上迁移而得到分离12/7/202212色谱分析-1一、方法的发展1959年，Porath和Flodin提出了大小排阻色谱法，其原理是利用柱内多孔填料对不同尺寸的分子具有选择渗透作用。80年代发展起来的毛细管电泳，解决了DNA及其片段、单克隆抗体、蛋白质及多肽等一般色谱技术难于解决的分离分析问题。现在已经派生出毛细管胶束电动色谱、毛细管等电聚焦、毛细管电泳离子分析法、微填充毛细管电泳法等多个新分支
5、。12/7/202213色谱分析-1二、仪器的发展五十年代第一台色谱仪问世12/7/202214色谱分析-1二、仪器的发展六十年代就有数台5公斤重的色谱仪随阿波罗飞船同登月球，自动取样分析，1970年更有一台100克重的色谱仪飞上了火星。12/7/202215色谱分析-1二、仪器的发展1967年时全世界共有色谱仪7万台1972年就发展到20万台现在我国的仪器就有数十万台过去庞大的体积，到现在的越来越小巧过去只有进口的，现在国产的也很好12/7/202216色谱分析-1二、色谱法的特点1分分离离效效率率高高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。2检检测测能
6、能力力强强：可以检测出10-1110-15克级的痕量组分，能满足环境检测、农药残留等大量日常检测分析的需要。3样样品品用用量量少少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。4适适用用范范围围广广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之地。12/7/202217色谱分析-1多模式及联用技术复杂样品靠单一分离方法或技术是不够的，需多模式及多项新技术的联用。v极性溶剂提取物可考虑用HPLCv有挥发性的化合物优先用GCv毛细管电泳是HPLC的补充和发展v联用技术是今后的趋势GC-MSLC-MSGC-MS-MSGC-FTIR12/7/202218色谱分析-1色谱基本理论12/7/202219色谱分析-1三、
7、色谱基本理论12/7/202220色谱分析-1色谱分离原理12/7/202221色谱分析-1基本关系式保留时间保留体积容量因子容量因子k12/7/202222色谱分析-1基本关系式相对保留值相对保留值是衡量分离情况的重要参数，大相对保留值是衡量分离情况的重要参数，大多数手册上可查到。因其只与色谱柱种类及多数手册上可查到。因其只与色谱柱种类及柱温有关，故也是重要的定性指标。柱温有关，故也是重要的定性指标。12/7/202223色谱分析-1基本关系式分离因子塔板数塔板高度N和H都有理论值和有效值两类,其差别在于用保留时间和校正保留时间12/7/202224色谱分析-1基本关系式（死时间测定）死时间
8、的测定很难：无合适样品无合适样品（完全不保留并有足够强的紫外信号）一般测定方法为（紫外检测器）：1.正向四氟乙烯反向苯甲酸、硝酸等 2.比流动相少一个C的同系物 3.不具备条件时可用下式计算12/7/202225色谱分析-1基本关系式（分离度）12/7/202226色谱分析-1基本关系式12/7/202227色谱分析-1柱性能参数：总孔率柱压降渗透率12/7/202228色谱分析-1色谱理论塔板理论塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础上发展起来的。他们把色谱柱比拟为分馏塔，中间设想成可分为许多分馏塔片（板）。他们假定：1流动相按前进方向以脉冲使通过柱子，最小单位为一塔板体积;2.组
9、分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在柱内的位置无关;3.组分在所有塔板上的两相平衡在瞬间建立;4.所有组分浓度以起始塔板中的浓度为基准12/7/202229色谱分析-1色谱理论塔板理论由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达成“平衡”所需的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡”次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。塔板理论回答了影响色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操作条
10、件的影响。12/7/202230色谱分析-1色谱理论速率理论1952年Lapidus等对填充柱色谱过程做了较详细的研究，指出色谱过程中引起组分宽度扩张的因素主要是：1.沿柱流动方向的纵向扩散效应；2.组分在两相间的平衡不能瞬时达成，即它在两相交换时传质速度是有限的。12/7/202231色谱分析-1色谱理论速率理论这就是著名的范底姆特方程。也可把VanDeemter方程描述为：12/7/202232色谱分析-1色谱理论速率理论与气相色谱不同，液相色谱有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）12/7/202233
11、色谱分析-1色谱理论速率理论各项可具体表述为：12/7/202234色谱分析-1色谱理论速率理论可图示为：12/7/202235色谱分析-1色谱理论速率理论最低板高：最佳流速：12/7/202236色谱分析-1色谱参考资料色谱参考资料12/7/202237色谱分析-1专著专著史坚编，现代柱色谱分析，上海科学技术文献出版社，1988.7.达世禄编色谱学导论色谱学导论武汉大学出版社，1988.10.周良模等编著，气相色谱新技术气相色谱新技术，科学出版社，1994.11.卢佩章等色谱理论基础色谱理论基础科学出版社，1989年第一版，1997年第二版.12/7/202238色谱分析-1专著专著任惠敏主
12、编的任惠敏主编的色谱技术丛书色谱技术丛书化学工业出版社，化学工业出版社，一套一套13本，涵盖所有色谱技术：本，涵盖所有色谱技术：色谱分析概论色谱分析概论 离子色谱方法及应用离子色谱方法及应用色谱定性和定量色谱定性和定量 毛细管电泳技术及应用毛细管电泳技术及应用气相色谱检测方法气相色谱检测方法 色谱分析样品处理色谱分析样品处理液相色谱检测方法液相色谱检测方法 色谱联用技术色谱联用技术气相色谱方法及应用气相色谱方法及应用 色谱柱技术色谱柱技术高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用 色谱仪器维护与故障排除色谱仪器维护与故障排除平面色谱方法及应用平面色谱方法及应用12/7/202239色谱分析-
13、1杂志杂志色 谱 科 学 杂 志（J，ChromatographySci）1963年创刊,原名气相色谱杂志（J,GasChromat）,1969年改为现名,主要发表气相、液相原始论文和总结性文章（英文）和色谱标准图谱。色谱杂志（J，Chromatograpy）1958年创刊,系多科性（包括气相、液相色谱，薄层色谱，纸色谱，离子交换色谱等）国际杂志，刊登各种原始论文及讲座性文章，并附有定性、定量数据及色谱文摘，文章以英文、法文或德文发表，从1993年起分A、B卷发行，每年还有Review专辑。12/7/202240色谱分析-1杂志杂志色层法（Chromatographia），1968年创刊，多科
14、性国际杂志，亦称色谱快报，文章以英文、法文、或德文发表，并附有三种文字的摘要。JouynalofChromatographyLibrary,不定期出版。液 相 色 谱 杂 志（J,ofLiquidChromatography）,1978年创刊,主要发表HPLC的研究报告。高分离色谱与色谱通讯（J.ofHighResolutionChromatographyandChromatographyCommunication）1978年创刊。12/7/202241色谱分析-1杂志杂志色谱，1984年创刊，刊登各种原始论文和综述，为双月刊。刊登色谱文章和评论性文章的还有各种分析化学相关的杂志，如各国的“分
15、析化学”（中、美、英、日、德等），中文的理化检验、环境化学等专业文献上也有相当比例的色谱论文发表。12/7/202242色谱分析-1手册手册手册是最方便地查阅相关文献的工具，尽管所列数据并非最新的。如1999年3月起再版的分析化学手册第二版，共10个分册：1-基础知识与安全知识2-化学分析3-光谱分析4-电分析化学5-气相色谱分析6-液相色谱分析7-核磁共振波谱分析8-热分析9-质谱分析10-化学计量学12/7/202243色谱分析-1学术会议文集学术会议文集每年都有不同组织者组织召开的国际国内的各种分析界的学术报告会，会议的文集也是一种很好的参考文献，值得收集阅读。全国色谱学术报告会和浙江省
16、色谱学术报告会均每两年举办一次，全国会议每次能征集到论文500篇以上，省会议也能征集到60篇以上。12/7/202244色谱分析-1色谱网站已已有有很很多多国国际际网网站站，包包括括美美国国化化学学会会的的网网站站，可搜索后查取相关文献。可搜索后查取相关文献。浙江省关于色谱方面的网站有：浙江省关于色谱方面的网站有： 12/7/202245色谱分析-1色谱柱系统色谱柱系统ChromatographicColumnSystem色谱柱是色谱分析的心脏色谱分析是分离方法，完成分离任务的色谱柱十分重要。固定相柱内不移动、起分离作用的物质，有固体和液体之分。12/7/202247色谱分析-11气固填充色谱
17、柱固定相为吸附剂，有以下特点：1)较大的比表面大于200M2/克2)较好的选择性3)良好的稳定性4)使用方便12/7/202248色谱分析-11.1吸附等温线与峰形状12/7/202249色谱分析-11.2传统固定相活性炭(ActivatedCarbon)非极性，分析永久性气体氧化铝(Alumina)中等极性，分析气体混合物硅胶(SilicaGel)氢键型，分析小分子烷烃分子筛(MolecularSieves)强极性，永久性气体12/7/202250色谱分析-1活性炭分离气体混合物12/7/202251色谱分析-1氧化铝分离汽油12/7/202252色谱分析-1分子筛分离永久性气体12/7/2
18、02253色谱分析-11.3传统固定相改性针对各自的固有弱点而展开：结构改性结构改性主要为扩大表面毛细孔径，使其比较均匀化学改性化学改性除去表面的活性基团(-OH等)氧化铝用不同浓度的KF改性作用不同(填或扩)。12/7/202254色谱分析-112/7/202255色谱分析-11.4新型气固色谱固定相石墨化炭黑(Cabopack系列，GCB系列)：加热使炭黑成片状石墨化结构，选择性提高，色谱峰形改善。碳分子筛(TDX系列等)：是高分子产品，对-CH2-保留强。多孔硅胶(Porasil系列等)：分离性能提高。高分子多孔小球(Porapak,Chropmosorb等):既是吸附剂又是载体，效果好
19、。12/7/202256色谱分析-1Poropak 固定相结构苯乙烯苯乙烯-二乙烯苯共聚体小球二乙烯苯共聚体小球12/7/202257色谱分析-1碳分子筛分离含硫化合物1.空气2.硫化氢3.氧硫化碳4.三氧化硫5.甲基硫醇6.二硫化碳12/7/202258色谱分析-1上试402有机载体(1)水 (2)甲酸 (3)乙酸 (4)丙酸 (5)丁酸粒度：20/80目，柱长：2米4mm，柱温：160 载气：H2 25ml/分 12/7/202259色谱分析-1Poropak Q 测溶剂中水 1.6英尺英寸(0D)SS.Porapak Q(150-200目)TC=220,He 37ml/min,TCD 1
20、2/7/202260色谱分析-12气液填充色谱柱在惰性固体表面涂渍高沸点有机化合物，以其特殊的性质进行分离。惰性固体载体有机化合物固定液12/7/202261色谱分析-11.气液色谱载体分为硅藻土和非硅藻土两大类，基本要求为：1)表面积大，孔径均匀表面积大，孔径均匀：承载更多固定液，并使液膜薄而均匀。2)惰性好惰性好：能附着固定液且不和样品反应。3)热稳定性和机械强度好热稳定性和机械强度好：保证柱效4)粒度均匀：便于填充粒度均匀：便于填充12/7/202262色谱分析-11.1硅藻土载体(DiatomiteSuport)由具有一定气孔的单细胞海藻残骸堆积而成，因此硅藻土保持了海藻的多孔结构.1
21、2/7/202263色谱分析-11)硅藻土载体性质两种硅藻土载体的化学组成、内部结构基本相似，但表面结构大不相同，性能也不同。品种特点承载固定液用途机械特性比表面催化性能红色好大4m2/g强多可达40%分析非极性样品白色差小1m2/g弱少可达20%分析极性样品12/7/202264色谱分析-12)载体吸附作用载体表面具有硅醇（Si-OH）和硅醚（Si-O-Si）结构，且有少量金属（如铁、铝）氧化物（特别是红色载体），故表面存在着氢键和酸碱活性作用点，是引起载体吸附甚至化学反应或催化反应的根本原因。12/7/202265色谱分析-13)吸附作用的消除酸洗酸洗：目的是除去载体表面上铁等金属氧化物碱
22、洗碱洗：目的是除去载体表面Al2O3等酸性杂质硅烷化硅烷化：目的是消附载体表面的硅醇基团，减弱生成氢键作用力。此法可拓展应用于特殊基团的引入釉化釉化：目的是堵塞载体表面的微孔和改变表面性质加脱活剂加脱活剂：用表面活性剂饱和(键合)载体表面的吸附中心。12/7/202266色谱分析-12.非硅藻土载体有多种类型，主要有：1)高分子小球：（如前述）2)氟载体：可分析腐蚀性气体或强极性物质，但柱效不高，且装填困难。3)玻璃微球：表面积小，渗透性好，但柱效低。12/7/202267色谱分析-1载体名称 硅藻土载体玻璃球石英球氟塑料化学组成多孔的硅藻土颗粒内含SiO2(6090%)Fe2O310%,Al
23、2O33950%,MgO少量。硬质玻璃组成的小球（其成分随原料不同而异）主 要 成 份 为SiO2含 量 占90%以上一般为聚四氟乙烯或聚三氟氯乙烯催化性能有小小很小最高使用温度硅烷化350一般500250500180涂渍固定液的难易易易易难用途通用载体低固定液，能在较低温度下分离沸点较高的化合物与玻璃球使用相同，温度上限高。用于分离强腐蚀性和强极性化合物12/7/202268色谱分析-12.气液色谱固定液为高分子有机化合物，在操作温度下必须呈液态，基本要求为：1)对组分有良好的选择性对组分有良好的选择性：使样品中各组分能彼此分离2)蒸气压低蒸气压低：减少色谱柱固定液的流失3)热稳定性和润湿性
24、好好热稳定性和润湿性好好：保证柱效4)化学惰性好化学惰性好：不与组分、载体、载气发生不可逆的化学反应 5)凝固点低，粘度适当，成分稳定凝固点低，粘度适当，成分稳定：12/7/202269色谱分析-12.1分子间作用力各组分之所以能在色谱柱中被分离，决定于分子间作用力的大小。作用力大的保留值大，留柱时间长，后出峰。主要有色散力色散力(非极性或弱极性分子之间的一种作用力)诱导力诱导力(极性分子与非极性分子之间使非极性分子极化而产生的力)12/7/202270色谱分析-12.1分子间作用力定向力定向力(极性分子间的永久偶极矩所引起分子间的一种作用力)氢键作用力氢键作用力(特殊的定向作用力)选择性分子
25、间作用力选择性分子间作用力的研究有很好前景。其实是“超分子化学”理论的不同表述而已。12/7/202271色谱分析-11)集团结构适应理论在色谱分离中，有许多反常例子，出峰顺序与常规分子间作用力大小有违（20种典型化合物在12种固定相上201个相对保留数据中有66个与预测值不相符）。由于分子中存在着各种集团，不同分子间的集团在电子性质及空间因素上各有不同。当它们互相适应时就能相互耦合，发生较强作用，宏观体现为后出峰。当它们不相适应时，虽有集团存在亦无这种加强作用。换言之，分子间引力存在某种选择性。提出了选择性分子间引力理论，或称“集团结构适应理论”。12/7/202272色谱分析-12)选择性
26、分子间力12/7/202273色谱分析-12.2固定液分类按按极性分极性分：可根据被测物极性的大小来查阅，方便地寻找极性相似的固定液作替代品按官能团分按官能团分：便于了解固定液的类别，可由结构考虑来选择固定相12/7/202274色谱分析-1A.按极性分类的考虑方法：选3根柱子：,氧二丙腈，角鲨烷，待测柱选两个评价物：苯环己烷测相对保留值计算相对极性：12/7/202275色谱分析-1按极性分类的考虑计算相对极性按20为一级分类12/7/202276色谱分析-1B.固定液特征常数概述以不同性质的多种物质分别考察某固定液，将得到不同结果。将这些数据按一定的规律归类，并命名为特征常数。由Rohrs
27、chneider于1966年首先提出，后由McReynods修正。12/7/202277色谱分析-11)评价物及意义罗氏罗氏作用情况作用情况符号符号麦氏麦氏苯苯电子给予体电子给予体X苯苯乙醇乙醇质子给予体质子给予体Y丁醇丁醇丁酮丁酮定向偶极力定向偶极力Z戊酮戊酮-2硝基甲烷硝基甲烷电子接受体电子接受体U硝基丙烷硝基丙烷吡啶吡啶质子接受体质子接受体S吡啶吡啶12/7/202278色谱分析-12)两种评价体系的差异罗氏评价物：在测定时需要用到气态烃类化合物，操作麻烦。麦氏正是针对该不足而提出，现广泛采用麦氏常数。色谱手册上有该参数，有按5种评价物数值的大小排列的，也有以五项指标值之和（或平均值）排
28、列的。12/7/202279色谱分析-13)部分固定液的部分固定液的McReynods常数常数值值固定液XYZUSSE-301655446642ApiezonL3222153242XE-60204381340493367XF-1125204381340493367OV-1011757456743SP-21001757456743QF-1144233355463305PEG20M32253636857251012/7/202280色谱分析-14)特征常数的应用1)判断固定液性质(极性大小、对哪类样品保留大)。2)选择替代品(常数基本相同的便可替代)。3)判断峰形好坏(在某固定相上已拖尾，则在常数
29、值大的柱上拖尾将更严重)。4)判断出峰顺序(常数值大的后出峰，且两数值之比大于1.5，可认为能很好分离)。5)用于合理选择固定相(根据样品中不同组分的主要性质差异，合理选择相应参数差值大的固定液)。12/7/202281色谱分析-1固定相的优选固定相众多，实验室不可能也没必要配全。推荐用固定相主要有：12/7/202282色谱分析-1名称缩写麦氏常数和D值最高使用温度1角鲨烷SQ001502甲基硅油SE-30,OV-101205-2291003503苯基(10%)甲基聚硅氧烷OV-34231943504苯基(20%)甲基聚硅氧烷OV-75922713505苯基(50%)甲基聚硅氧烷DC-710
30、,OV-17827-8843773756苯基(60%)甲基聚硅氧烷OV-2210754883507三氟丙基(50%)甲基聚硅氧烷OV-10,QF-11500-25507092758氰乙基(25%)甲基聚硅氧烷XE-6017858212509聚乙二醇-20000PEG-20M2308105222510 聚乙二醇二乙二酸酯DEGA2764129520011 聚丁二醇二乙二酸酯DEGS3504161220012 1,2,3-三(2-氰乙氧基)丙烷TCEP4145188517512/7/202283色谱分析-1键合固定相以分子键的形式将固定液键合到适当的载体上，减少流失损失。再适当胶联聚合，进一步提高
31、性能，尤其是对毛细管柱。主要的键和体系是以PEG系列为对象。引入特殊基团可提高柱选择性(类似于具有选类似于具有选择作用的螯合树脂择作用的螯合树脂)。12/7/202284色谱分析-1混合固定相单一固定液不能满足分离需要时可考虑用混合柱。混合模式：混合涂混合装单柱串联前两法的效果基本相近，较另一法好。12/7/202285色谱分析-1混合固定相配比选择可用窗口法求出合适的固定液比12/7/202286色谱分析-1混合固定相配比选择12/7/202287色谱分析-1程序柱按预先设置的程序，按一定方式装填固定相而制成的柱子。可改变的因素有：液载比、载体粒度、装填长度。组合恰当，可得很好的分离效果。1
32、2/7/202288色谱分析-14)固定液选用原则“相似相溶原相似相溶原则则”被分离样品为非极性物质，一般选用非极性固定液。被分离的样品为极性物质，则一般先用极性固定液。被分离样品为极性物质（或易被极化物质）和非极性物质的混合物，一般也选用极性固定液12/7/202289色谱分析-14)固定液选用原则被分离的样品若为形成氢键的物质，一般选择极性或氢键型固定液被分离样品为具有酸性和碱性（吡啶类）的极性物质，会产生严重拖尾，一般选用极性固定液，并加酸性或碱性减尾剂12/7/202290色谱分析-14)固定液选用原则被分离样品为异构体，一般选用强极性或有特殊作用力的固定液被分离样品为不同族的混合物，
33、视具体情况而定，或用单一固定液，或用混合物固定液。12/7/202291色谱分析-15)固定液使用中的有关问题A固定液的纯度和精制固定液的纯度和精制固定液是一种高沸点的有机物，由于固定液的生产过程、包装、贮存和供应等方面的问题，有时会使得固定液中含有影响色谱分析的杂质，即达不到要求的纯度。如商品邻苯二甲酸酯和磷酸二甲酯中混有酸性化合物，聚酯和聚乙二醇等往往含有低聚物。因此，此类固定液在使用前必须予以精制。目前常用固定液精制的方法有精密分馏和气相色谱分离纯化两种，后法简便、快速，得到的固定液纯度可达99.99%以上，但需用制备色谱仪，前法在实验室就可进行。12/7/202292色谱分析-1B固定
34、液的最高使用温度和最低使用温度固定液的最高使用温度和最低使用温度固定液虽是高沸点有机物，但也不能在太高的温度下使用。该限制温度即谓最高使用温度，它应比相应固定液的沸点低大约150200。超过最高使用温度可能使固定液变质，产生流失现象或者缩短色谱柱的寿命。有的固定液使用温度有一个“下限”，即最低使用温度。低于此温度，固定液溶解被测组份的能力降低，或分离效果很差。如二甲基硅橡胶最低使用温度为100125、阿匹松L的最低使用温度为75、六环聚苯醚的最低使用温度为75等等。12/7/202293色谱分析-1C.固定液的涂渍与老化色谱柱质量还与固定液能否均匀分布在载体表面以及填充情况有密切的关系。当选好
35、固定液后，还需要确定固定液与载体的量比(液载比液载比，3:100到10:100)。固定液一般采用动态法涂涂渍渍：涂渍须在通风柜进行。称取一定量固定液溶解在适当的有机溶剂中(必要时可回流)，然后加入一定量经过处理和筛分过的载体，在适当温度下轻轻拍打烧杯，待其中所有溶剂完全挥发后即涂渍完毕。12/7/202294色谱分析-1C.固定液的涂渍与老化涂渍完毕还需进行老老化化处理，其目的有二：彻彻底底除除去去填填充充物物中中的的残残余余溶溶剂剂和某某些些挥挥发发性性杂杂质质，促进固定液均匀牢固地分布于载体表面。老化操作通常在较低的载气流速、略高于操作柱温，但又不超地固定液的最高使用温度的条件下，加热十几
36、个小时，然后接入正常气路，直至记录器上的基线平直，就可进行分析。12/7/202295色谱分析-1D.色谱柱柱体的选择，试漏和清洗色谱柱柱体的选择，试漏和清洗填 充 色 谱 柱 一 般 是 玻 璃 柱 或 不 锈 钢 柱(34mm14m)，根据实验条件(如柱压柱温)和样品性质(如反应性能、腐蚀性等)选择合适柱材，现多为螺旋形(螺旋直径与柱内径之比一般为15：1到25：1)。柱子使用前都需进行试漏和清洗。试试漏漏方法：将柱出口堵死后浸在水里，通气，在高于操作压力下，不应有气泡冒出。柱的清清洗洗与柱材有关：一般有碱洗、水洗、有机溶剂洗。12/7/202296色谱分析-1 E.固定相的填充固定相的填
37、充一般采用泵抽法填充，在柱的一端（以后接检测器那端）填入少量玻璃棉后用布包紧，接上真空泵抽气，另一端用小漏斗加入固定相，在不断轻轻敲击柱身中直至填满。要注意的是，敲打不能过重，以免载体碎裂；对涂渍低沸点固定液的固定相不宜用泵抽法；装填要均匀，不要太松或太紧。12/7/202297色谱分析-1F、其他柱子其他柱子现在多采用毛细管柱进行分离，它的处理以后专门论述。12/7/202298色谱分析-1柱故障的诊断与排除 (1.多出峰)有两种类型的附加峰有两种类型的附加峰1.1.即使不进样也会出现的峰即使不进样也会出现的峰 (鬼峰鬼峰)，并且在色谱分析并且在色谱分析过程中也会出现在真实的峰之中过程中也会
38、出现在真实的峰之中 2.2.由样品产生的附加峰由样品产生的附加峰12/7/202299色谱分析-1鬼峰o 柱头污染o烘焙色谱柱，然后做空运行（无样品）o进样垫流失使用高质量的产品o进样口污染 残留在进样口或衬管中的物质o载气不纯使用高纯度的载气及高质量的气体净化器，并定期更换o载气中杂质与固定相发生反应 o若使用分离/无分流进样口进样口底部的密封垫可能会与样品反应使用精制进口密封垫12/7/2022100色谱分析-1样品产生的附加峰样品产生的附加峰o即使进纯样，也会出现附加峰o做一次空运行-o如果这些峰还存在，不是由样品产生的，按照前面介绍的方法检查o进样口温度过热，可以导致样品组分的降解o每
39、次将进样口降低20，观察峰是否仍出现o衬管与样品起反应o使用脱活的衬管o衬管内填充物有活性o更换衬管内填充物或使用无填充物的衬管12/7/2022101色谱分析-1样品产生的附加峰样品产生的附加峰o样品在进样口停留的时间太长o增加柱流速o样品组分稳定性差o尽可能降低进样口温度o使用脉冲式无分流或脉冲式分流进样12/7/2022102色谱分析-1柱故障的诊断与排除 (2.丢失峰)o进样口温度太低高沸点的化合物不能很快地气化增加进样口温度o进样口温度太高许多挥发性的组分在进样口降解 降低进样口温度o进样口被污染进样口的污染物与样品发生反应清洗进样口，更换衬管和进样垫o衬管有活性使用脱活的衬管 色谱
40、图中没有出现你希望得到的样品组分峰色谱图中没有出现你希望得到的样品组分峰12/7/2022103色谱分析-1柱故障的诊断与排除o柱过载将样品稀释10倍重新进样o使用较厚液膜但固定液相同的色谱柱o减少进样量小体积进样 增加分流比o可能是几个未分离的色谱峰将柱温降低20再进样局部的分离可以显示其它额外的样品组分峰型不好12/7/2022104色谱分析-1柱故障的诊断与排除o使用较长的色谱柱o试一试不同选择性或不同极性的柱子 如将HP-1换成HP-5如将HP-5换成HP-35或HP-50+例如半挥发性的苯甲酸（色谱性能不好）峰型不好12/7/2022105色谱分析-1柱故障的诊断与排除峰型很差o合并
41、的峰（未分离的峰）o将柱温降低20-30o在进样口的底部安装柱子的地方安装绝缘帽绝缘帽o将进样口温度增加20-30o检查样品与溶剂的选择是否正确o对极性的化合物使用极性的溶剂峰顶分叉（双肩峰）10612/7/2022106色谱分析-1柱故障的诊断与排除峰型很差检测器过载减少进样量或将样品稀释10倍 或者使用较大的分流比 稀释样品可以达到较好的效果峰顶分叉（双肩峰）10712/7/2022107色谱分析-1色谱柱安装位置引起的问题o色谱柱到检测器安装位置不正确;使其不能到达FID喷嘴o色谱柱到进样口安装位置不正确.使其不能到达进样口o色谱柱到进样口及检测器的位置安装正确10812/7/20221
42、08色谱分析-1色谱柱安装到进样口 评定因素评定因素o安装深度-柱到针的间隙按照厂方的介绍,在进样针头到柱保留1-2厘米的间隙 o对分析物和样品基质选择适用的衬管o使用专用的柱切割器o保证所有的柱接头及其它接口不漏12/7/2022109色谱分析-1高效液相色谱法的相关情况高效液相色谱法的相关情况液相色谱柱的保养液相色谱柱的保养柱的稳定性与固定相类型及使用情况有关。如流动相中盐类的存在会使键合相柱的性能衰退；以SiO2为基质的固定相，过程随温度和pH(8)增加而加速。一根柱子使用是否得当，直接影响它的柱效和寿命。对于填装了粒度为10m以下的固定相的柱子，尤其如此。为了保持柱效、柱容量及渗透性，
43、必须进行仔细地保养。是否会由于柱外效应，使分析柱的柱效明显下降？12/7/2022111色谱分析-1液相色谱柱的保养液相色谱柱的保养1柱易被极细的颗粒堵塞，因此必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流动相贮槽与柱之间，使用0.5m孔径的过滤器。水往往是一个重要的污染源。在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防止细菌生长的办法是加入抑制剂，如0.01%NaNO3。显然，抑制剂不能干扰分离和测定。12/7/2022112色谱分析-1液相色谱柱的保养2在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除堵塞物，但必
44、须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，以扰动柱内的固定相层，使柱效发生变化。12/7/2022113色谱分析-1液相色谱柱的保养液相色谱柱的保养3柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力的一半以下。实际操作压力过高，易使入口的固定相层下沉，形成一个空穴。若空穴形成，应重新装柱。在空穴中加入新的匀浆或玻璃微珠，也无法恢复到原来的柱效。4应该用进样阀，而不用注射器进样，以防止注射隔膜碎屑集聚在柱入口。12/7/2022114色谱分析-1液相色谱柱的保养液相色谱柱的保养5要防止反冲（流动相逆向流动），否则使固定相层位移，柱效下降。6柱子两端用金属螺帽封闭，保存在纯净的有机溶剂中。
45、应该将柱子保存在以下pH范围内的水溶液流动相中：2pH1.05)。12/7/2022179色谱分析-14.流动相的物理参数流动相的物理参数1)溶解度参数（溶剂极性的量度）：与样品分配比有关，要适中。2)沸点：要低些，便于回收分离样品。3)粘度：柱效与粘度成反比，要求早在0.40.5cP。混合溶剂一般能降低粘度。12/7/2022180色谱分析-15.混合溶剂混合溶剂可靠改变溶剂组成来调节溶剂的强度等，以适合不容的样品。等度淋洗：淋洗过程中溶剂组成不变，强度恒定，k值在10以内可得较好的分离。梯度淋洗：淋洗过程中溶剂组成随时间而变，一般使强度按程序增加，使组分在最合适的k值处洗出。12/7/20
46、22181色谱分析-1梯度淋洗梯度淋洗使用于极性范围宽的混合物的分离。优点：提供限单位时间内的最大分离度。提高出峰的对称性减小峰宽降低检测12/7/2022182色谱分析-1梯度淋洗梯度淋洗问题：要用高纯试剂（贵贵）。可能在固定相上产生杂质富集，需再生处理（尤其是极性柱），可用1030倍柱体积的溶剂淋洗。12/7/2022183色谱分析-16.流动相的选择性分组1类脂肪族醚，三级烷胺2脂肪醇3四氢呋喃,吡啶,二甲基甲酰胺,二甲亚砜4乙二醇,乙酸,甲酰胺5二氯甲烷,1,2-二氯乙烷6乙腈,乙酸乙酯,二氧六环7苯,甲苯,二甲苯,硝基甲烷,硝基乙烷,甲乙酮8氯仿,水12/7/2022184色谱分析-
47、16.流动相的选择性分组同组溶剂性质相似，当某组溶剂分离不好时，可选另一组溶剂替代。12/7/2022185色谱分析-112/7/2022186色谱分析-1气相色谱由高压钢瓶直接提供气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，而液相色谱流动相需动力，而液相色谱流动相需要用泵加压后能按要求使用。要用泵加压后能按要求使用。3.流动相的的运作流动相的的运作12/7/2022187色谱分析-11)输出压力高输出压力高：一般至少要有：一般至少要有1535MPa,最高最高有有50MPa。2)流量范围大流量范围大：分析型在：分析型在0.110mL/min内连内连续调节，制备型要求在续调节，制备型要求在100mL以上。以
48、上。3)流量稳定流量稳定：要求无脉冲，精度重复性在：要求无脉冲，精度重复性在0.5%左右。左右。4)耐腐蚀：耐腐蚀：能适合各种有机溶剂、水和缓冲溶液。能适合各种有机溶剂、水和缓冲溶液。5)其他其他：密封、小巧、便于清洗和维护等。：密封、小巧、便于清洗和维护等。1.泵的要求泵的要求12/7/2022188色谱分析-1主要有恒流和恒压两种模式，前者更多见，主要有恒流和恒压两种模式，前者更多见，主要有往复柱塞泵和螺旋注射泵。后者有主要有往复柱塞泵和螺旋注射泵。后者有气动泵等。气动泵等。HPLC有很多种泵在工作，如往复泵、柱塞有很多种泵在工作，如往复泵、柱塞泵等。泵等。2.泵的类型泵的类型12/7/2
49、022189色谱分析-11）气动泵气动泵直接式，简单，但高压气体可溶解于溶剂中，当溶剂进入检测器时会放出气体影响检测。12/7/2022190色谱分析-1压力由两活塞的面积比决定。操作简便，流量范围大，但流速取决于溶剂粘度和柱渗透性。液缸大不便清洗。流量有波动。2）气动放大泵气动放大泵12/7/2022191色谱分析-1步进步进马达控制活马达控制活塞移动，同时控塞移动，同时控制流量。至限位制流量。至限位开关时停泵后退开关时停泵后退活塞、吸液，然活塞、吸液，然后继续。压力大后继续。压力大（可达（可达60 MPa），），无脉冲。无脉冲。但清洗不便，精但清洗不便，精密而价高。密而价高。3）螺旋注射泵
50、螺旋注射泵12/7/2022192色谱分析-1目前应用较多。目前应用较多。偏心轮带动活偏心轮带动活塞往复移动，塞往复移动，恒流输出，并恒流输出，并通过改变电机通过改变电机转速调节流量。转速调节流量。体积小清洗方体积小清洗方便，特别适用便，特别适用于梯度淋洗。于梯度淋洗。4）往复柱塞泵往复柱塞泵有明显脉冲需采取措施：增加有明显脉冲需采取措施：增加脉冲阻尼器、改变凸轮形状、脉冲阻尼器、改变凸轮形状、加电子线路保护、用多头泵系加电子线路保护、用多头泵系统统(并联串联并联串联)等。等。12/7/2022193色谱分析-1并联双柱泵少用一并联双柱泵少用一组单向阀。用两相组单向阀。用两相差差180度的凸轮