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1、 第第3 34 4章章 DNADNA的复制和修复的复制和修复 （DNA Replication and Repair）内内 容容 DNADNA的复制的复制DNADNA的损伤和修复的损伤和修复DNADNA的突变的突变 DNADNA是是生生物物遗遗传传的的主主要要物物质质基基础础，生生物物机机体体的的遗遗传传信信息息以以密密码码的的形形式式编编码码在在DNADNA分分子子上上，表表现现为为特特定定的的核核苷苷酸酸排排列列顺顺序序，并并通通过过DNADNA的的复复制制由由亲亲代代传传递递给给子子代代。19531953年年Watson Watson&CrickCrick提提出出DNADNA双双螺螺旋旋
2、结结构构模模型型后后，19581958年年，CrickCrick提提出出了了“中中心心法法则则”(”(Central Central dogma)dogma)揭揭示示了了遗遗传传信信息的传递规律。息的传递规律。蛋白质蛋白质逆转录逆转录翻译翻译转录转录复制复制复制复制DNADNARNARNA第一节第一节 DNADNA的复制的复制 DNADNA的复制：是指以原来的复制：是指以原来DNADNA分子为模板合成分子为模板合成出相同分子的过程。出相同分子的过程。一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制 DNADNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNADNA聚聚
3、合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的链，以组成新的DNADNA分子。这样新形成的两个分子。这样新形成的两个DNADNA分子与亲代分子与亲代DNADNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNADNA分子中一条分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制留复制(semi conservative replication)semi conservative replication)。Parental Strands
4、Strand duplication1/2 old1/2 newStrand separation半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明 19581958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl的实验首次有力地的实验首次有力地支持了半保留复制方式。支持了半保留复制方式。实验步骤：实验步骤：.大肠杆菌放在大肠杆菌放在1515NHNH4 4C1C1培养基中生长培养基中生长1212代。代。.再将细菌移到只含有再将细菌移到只含有1414NHNH4 4C1C1的培养基中的培养基中 培养。培养。.裂解细胞。裂解细胞。.将裂解液放在将裂解液放在CsC1CsC1溶液中进行密度梯度离溶液中
5、进行密度梯度离 心。心。.在紫外光下可以看到形成的区带。在紫外光下可以看到形成的区带。二二 、DNADNA复制的起点和方式复制的起点和方式v复制子复制子:DNADNA复制从起点开始直到终点为止，每复制从起点开始直到终点为止，每一个这样的一个这样的DNADNA单位称为复制子或复制单元单位称为复制子或复制单元(repliconreplicon)。v复制起点复制起点:DNADNA复制在生物细胞中要从复制在生物细胞中要从DNADNA分子分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点点(Origin of replication)Origin of repli
6、cation)，用用oriori表示。表示。v复制叉复制叉:DNADNA复制的生长点形状如同分叉故称为复制的生长点形状如同分叉故称为复制叉复制叉(replication fork)replication fork)。原原核核生生物物的的染染色色体体和和质质粒粒，真真核核生生物物的的细细胞胞器器DNADNA都都是是环环状状双双链链分分子子。实实验验表表明明，它它们们都都在在一一个个固固定定的的起起点点开开始始复复制制，复复制制叉叉移移动动方方向向大大多多是是双双向向的的，即即形形成成两两个个复复制制叉叉或或生生长长点点，分分别别向向两两侧侧进行复制；进行复制；也有的是单向的，只形成一个复制叉或生
7、长点也有的是单向的，只形成一个复制叉或生长点DNA的双向和单向复制的双向和单向复制复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制环状环状 DNA复制时所复制时所形成的形成的q q结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进 用遗传学和用遗传学和生物化学的方法生物化学的方法可以确定大肠杆可以确定大肠杆菌染色体菌染色体DNADNA的复的复制起点在基因图制起点在基因图谱上的位置。谱上的位置。起点起点oriCoriCilvthr0/180Lacattl l255075malAcysCtryAhistrpTre终点终点大肠杆菌复
8、制起点和终大肠杆菌复制起点和终点在基因图谱上的位置点在基因图谱上的位置Evidence points to bidirectional replicationLabel at both replication forksDNA复制的不同方式复制的不同方式 A.A.直线双向直线双向B.B.多起点双向多起点双向C.C.型双向型双向D.D.型单向型单向 E.E.滚动环滚动环F.F.环环A.直线双向直线双向三、三、DNADNA聚合反应有关的聚合反应有关的酶酶反应式反应式：n1dATP DNA polE dAMP n2dGTP +DNA dGMP n3dCTP Mg2+dCMP n4dTTP dTMP
9、DNA 1 1DNADNA的聚合反应和聚合酶的聚合反应和聚合酶 19561956年，年，KornbergKornberg在大肠杆菌提取液中发在大肠杆菌提取液中发现现DNADNA聚合酶，以后陆续在不同生物中找到。聚合酶，以后陆续在不同生物中找到。+(n1+n2+n3+n4)PPiDNADNA聚合酶的反应特点：聚合酶的反应特点：以四种脱氧核苷酸三磷酸以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPdNTP)为底物为底物;反应需要模板的指导反应需要模板的指导;反应需要有引物反应需要有引物3-3-OHOH存在存在;DNADNA链的生长方向是链的生长方向是5353产物产物DNADNA的性质与模板相同的性质与模板相同。D
10、NA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应35533553由由DNA聚合酶催化的聚合酶催化的DNA合成反应合成反应ABCD 模板模板-引物引物 产物产物2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌共有大肠杆菌共有5 5种不同的种不同的DNADNA聚合酶：聚合酶：DNADNA聚合酶聚合酶，IIII，IIIIII，IVIV，V V。DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase,DNA(DNA polymerase,DNA polpol)理化性质：理化性质：纯化的纯化的DNA DNA polpol由一条多肽链组成，多肽链中由一条多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。酶分子空
11、间含有一个锌原子。酶分子空间结构近似球体。结构近似球体。DNA DNA polpol约约含含10001000个氨基酸残基，个氨基酸残基，MWMW为为103KD103KD。经蛋白酶处理后，经蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：大片酶分子分裂成两个片段：大片段（段（KlenowKlenow片段）有聚合酶和片段）有聚合酶和3535外切酶活性，小片段有外切酶活性，小片段有5353外切酶活性。外切酶活性。53外切酶活性外切酶活性35外切酶活性外切酶活性聚合酶聚合酶NCKlenow片段片段(MW68 kD)小片段小片段(MW35 kD)蛋白酶蛋白酶功能：功能：聚合功能聚合功能:通过核苷酸聚合反应使通过核苷
12、酸聚合反应使DNADNA链沿链沿5353方方向延长。在引物向延长。在引物DNADNA或或RNA-OHRNA-OH末端，以末端，以dNTPdNTP为底物，按模板为底物，按模板DNADNA上的指令由上的指令由DNApolDNApol逐逐个将核苷酸加上去，就是个将核苷酸加上去，就是DNA DNA polpol的聚合的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板核苷酸必须与模板DNADNA配对时才有催化作用。配对时才有催化作用。3535外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用:这种酶活性的主要功能是从这种酶活性的主要功能是从3535方向方向识别和切除不配
13、对的识别和切除不配对的DNADNA生长链末端的核生长链末端的核苷酸（对单链作用）。苷酸（对单链作用）。5353外切酶活性就是从外切酶活性就是从5353方向水解方向水解DNADNA生长链前方的生长链前方的DNADNA链，主要产生链，主要产生5-5-脱氧核苷脱氧核苷酸。酸。这种酶活性只对这种酶活性只对DNADNA上配对部分上配对部分(双链双链)磷酸二磷酸二酯键有切割活力作用，方向是酯键有切割活力作用，方向是53 53。每次。每次能切除能切除1010个核苷酸。个核苷酸。这种酶活性在这种酶活性在DNADNA损伤的修复中可能起着重要损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚作用（切除
14、由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段体）。对冈崎片段55末端末端RNARNA引物的去除依赖引物的去除依赖此种外切酶活性。此种外切酶活性。5353外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用:焦磷酸解作用焦磷酸解作用:DNApolDNApol的这种活性可的这种活性可以催化以催化33末端焦磷酸解末端焦磷酸解DNADNA分子。分子。焦磷酸交换作用焦磷酸交换作用:催化催化dNTPdNTP末端的末端的PPiPPi同无机焦磷酸的交换反应。同无机焦磷酸的交换反应。这两种作用，都要求有较高浓度的这两种作用，都要求有较高浓度的PPiPPi，因此，在体内由于没有足够高的因此，在体内由于没有足够高的PPiP
15、Pi而无而无重要意义。重要意义。DNADNA聚合酶聚合酶 （DNA DNA polIIpolII)DNADNA聚合酶聚合酶缺陷的突变株仍能生存，这缺陷的突变株仍能生存，这表明表明DNA DNA polpol不是不是DNADNA复制的主要聚合酶。复制的主要聚合酶。19701970年发现了年发现了DNApolDNApol。此酶为多亚基，此酶为多亚基，MW 88KDMW 88KD，每个细胞内约有每个细胞内约有100100个酶分子。个酶分子。催化特性催化特性：5353聚合酶活力聚合酶活力:该酶催化该酶催化DNADNA的聚的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模
16、板是双链模板是双链DNADNA而中间有空隙而中间有空隙(gap)(gap)的单链的单链DNADNA部份，而且该单链空隙部份不长于部份，而且该单链空隙部份不长于100100个个核苷酸。核苷酸。3535外切酶活性，但无外切酶活性，但无5353外切酶活外切酶活性。性。该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的缺陷的大肠杆菌突变株的DNADNA复制都正常。复制都正常。DNADNA聚合酶聚合酶组成组成 ：DNA DNA polpol 全酶是由多种亚基组成全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞
17、内真正负责从新合成大肠杆菌细胞内真正负责从新合成DNADNA的复的复制酶。制酶。DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体功能功能A A聚合聚合:以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有底物，并且需要有33 的引物链存在，的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使通过核苷酸聚合反应使DNADNA链沿链沿5353方向方向延长。延长。催化脱氧核苷酸掺入催化脱氧核苷酸掺入DNADNA链的速率分别是链的速率分别是DNADNA聚合酶聚合酶和和I I的的1515倍和倍和3030倍。倍。B B 3535
18、外切酶活性外切酶活性大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNADNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用聚合酶作用3-5 核酸核酸外切酶作用外切酶作用5-3 核酸核酸外切酶作用外切酶作用合成速度（核苷酸合成速度（核苷酸/分）分）持续合成能力持续合成能力DNA聚合酶聚合酶103,000400+1,000-1,2003-20088,000100+-2,4001,500830,00010-20+-15,000-60,000500,000比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶III切除引物切除引物修复修复修复修复复制复制功能功能聚合酶聚合酶IV
19、IV 和和V:V:19991999年发现年发现,它们涉及它们涉及DNADNA的错误倾向修复的错误倾向修复(error prone repairerror prone repair）DNADNA连接酶是连接酶是19671967年在三个实验室同时发现的。年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭它是一种封闭DNADNA链上切口酶，借助链上切口酶，借助ATPATP或或NADNAD水解水解提供的能量催化提供的能量催化DNADNA链的链的5-PO5-PO4 4与另一与另一DNADNA链的链的5-5-OHOH生成磷酸二酯键。生成磷酸二酯键。这两条链必须是与同一条互补链配对结合的这两条链必须是与同一条互补链配对
20、结合的(T4DNA(T4DNA连接酶除外连接酶除外)，而且必须是两条紧邻，而且必须是两条紧邻DNADNA链才链才能被能被DNADNA连接酶催化成磷酸二酯键。连接酶催化成磷酸二酯键。DNADNA连接酶的主要功能就是在连接酶的主要功能就是在DNADNA聚合酶聚合酶催化催化聚合，填满双链聚合，填满双链DNADNA上的单链间隙后封闭上的单链间隙后封闭DNADNA双链上双链上的切口。这在的切口。这在DNADNA复制、修复和重组中起着重要的复制、修复和重组中起着重要的作用。作用。3.DNA3.DNA连接酶连接酶(DNA(DNA ligaseligase)连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶AT
21、P或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPTGGP切口33555533模板链模板链模板链模板链四、四、DNADNA的的半不连续复制半不连续复制冈崎片段：冈崎片段：19681968年，冈崎等用年，冈崎等用3 3H H脱氧胸苷标记脱氧胸苷标记T4T4噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的度离心法分离标记的DNADNA产物，发现短时间内首产物，发现短时间内首先合成的是较短的先合成的是较短的DNADNA片段，接着出现较大的分片段，
22、接着出现较大的分子。最初出现的子。最初出现的DNADNA片段长度约为片段长度约为10001000个核苷酸个核苷酸左右，称为冈崎片段（左右，称为冈崎片段（OkzakiOkzaki fragment fragment）。）。复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解解链酶链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB335前导链前导链滞后链滞后链35复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5RNA引物引物33 RNA引物的合成：引物的合成：以以DNA为模板，为模板，NTP为原料，在引物合成酶催化下，合成为原料，在引物合成酶催化下
23、，合成10-几十个核苷酸。几十个核苷酸。为什么？为什么？这是保证这是保证DNADNA聚合过程高度精确的又一措施。已知聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA DNA 聚合聚合酶具有酶具有3 35 5 外切酶功能校对复制过程中的核苷酸外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始低忠实性的多核苷酸来开始DNADNA的合成，并以核糖核苷酸来表的合成，并以核糖核苷酸来表示是示
24、是“暂时暂时”的，当的，当DNADNA聚合以后再将其切除，以高忠实性的聚合以后再将其切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。在学的关系。在DNADNA的复制、重组、转录和组装等的复制、重组、转录和组装等过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerasetopoisomerase)：DNADNA在复制过程在复
25、制过程中双链需要解开。能引起中双链需要解开。能引起DNADNA拓扑异构反应的酶拓扑异构反应的酶为拓扑异构酶。为拓扑异构酶。DNADNA拓扑酶催化同一拓扑酶催化同一DNADNA分子不同分子不同超螺旋状态之间的转变。超螺旋状态之间的转变。五、五、复制中的拓扑学问题复制中的拓扑学问题DNADNA拓扑异构酶有两类：拓扑异构酶有两类：类型类型的酶的酶拓扑异构酶拓扑异构酶，能使，能使DNADNA的一的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，可减少负超螺旋。可减少负超螺旋。类型类型的酶的酶拓扑异构酶拓扑异构酶（旋转酶），能（旋转酶），能使使DNADNA的两条链同时发
26、生断裂和再连接，当它的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由引入超螺旋时需要由ATPATP供给能量，可引入负供给能量，可引入负超螺旋，超螺旋，它们协同作用控制着它们协同作用控制着DNADNA的负超螺旋水平。的负超螺旋水平。原核细胞拓扑构酶原核细胞拓扑构酶的作用机制：的作用机制：酶与酶与DNADNA结合使双链解旋结合使双链解旋;使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转旋转;酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来;酶从酶从DNADNA上脱落，两条链复原，得到的上脱落，两条链复原，得
27、到的DNADNA比原来少一比原来少一个负性超螺旋。个负性超螺旋。拓扑构酶拓扑构酶II的作用机制：的作用机制：该酶能暂时性地切断和重新连接双链该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNADNA，引入负超引入负超螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。促进双链的解开。真核生物拓扑构酶真核生物拓扑构酶 拓扑构酶拓扑构酶I：消除正、负超螺旋消除正、负超螺旋类型类型I 拓扑构酶拓扑构酶III：消除负超螺旋消除负超螺旋 拓扑构酶拓扑构酶II：消除正、负超螺旋，不能引消除正、负超螺旋，不能引类型类型II 拓扑构酶拓扑构酶II：消除正、负超螺旋消除
28、正、负超螺旋入负超螺旋入负超螺旋入负超螺旋入负超螺旋大肠杆菌旋转酶（大肠杆菌旋转酶（gyrase)又称为拓扑构酶又称为拓扑构酶II，反应需反应需ATP提供能量，提供能量，可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生的扭曲张力。产生的扭曲张力。将将DNADNA两条链解开，有赖于两条链解开，有赖于DNADNA解螺旋酶，这类酶通过解螺旋酶，这类酶通过水解水解ATPATP获得能量来解开双链，分解获得能量来解开双链，分解ATPATP的活力要有单的活力要有单链链DNADNA的存在。的存在。如双链如双链DNADNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合中有单链末端或缺口，解
29、螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。于单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶大肠杆菌解螺旋酶、和和可以沿模板链的可以沿模板链的5353方向随着复制叉的前进而移动，而方向随着复制叉的前进而移动，而reprep蛋白则蛋白则在另一条模板链上沿在另一条模板链上沿3535方向移动。这两种解螺方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着旋酶的配合作用推动着DNADNA双链的解开。双链的解开。单链结合蛋白单链结合蛋白(SSB)(SSB)：可阻止复性和保护解开的单链。可阻止复性和保护解开的单链。DNADNA解螺旋酶解螺旋酶(DnaBDnaB)六、六、DNADNA复制的过程复制的过程分三个阶段：分
30、三个阶段：起始起始延伸延伸终止终止大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列1.1.复制的起始复制的起始DnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型DnaA大肠杆菌结合在复制起点的蛋白质大肠杆菌结合在复制起点的蛋白质DNADNA复制的调节复制的调节lDNADNA复制的调节的调节在起始阶段，一旦开复制的调节的调节在起始阶段，一旦开始
31、就一直到完始就一直到完lDNADNA复制的起始与复制的起始与DNADNA的甲基化和细菌脂膜的的甲基化和细菌脂膜的相互作用有关相互作用有关loriCoriC 位点的回文序列位点的回文序列GATCGATC（1111个）的甲基个）的甲基化化l新合成链的甲基化滞后新合成链的甲基化滞后13 13 minminA replisome consists of:DNA gyrase,the priming complex(primosome,helicase,primase,primer),SSB,and DNA polymerase III holoenzyme 2.复制的延伸复制的延伸聚合酶聚合酶III核
32、心酶核心酶聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶(DnaG)RNA引物引物引发体引发体拓扑异构酶拓扑异构酶II-夹子夹子-聚体聚体-夹子夹子 -复合物复合物RNA引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）3.复制的复制的终止终止oriC复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶IV连锁染色体连锁染色体修复复制修复复制22 bpTusTusterminus utilization substance七、真核生物七、真核生物DNA的复
33、制的复制起点复制：称作自体复制顺序起点复制：称作自体复制顺序（autonomously replicating autonomously replicating sequence,ARSsequence,ARS）或复制基因（或复制基因（replicatorreplicator）。）。酵母酵母ARSARS约有约有150150个个bpbp，含有几个保守序列，含有几个保守序列，这表明在真核生物这表明在真核生物DNADNA中有多个复制的起点。中有多个复制的起点。真核生物真核生物DNADNA的复制的起始还需要一个原点识的复制的起始还需要一个原点识别复合物（别复合物（ORCORC），），受控制真核生物细胞
34、周期受控制真核生物细胞周期的蛋白质的调控。的蛋白质的调控。1.1.多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点 冈崎片段冈崎片段：100-200个核甘酸个核甘酸2.2.存在复制叉存在复制叉 真核生物真核生物DNADNA复制过程中也出现复制叉，复制过程中也出现复制叉，而复制叉的移动速度较原核生物慢，仅为原而复制叉的移动速度较原核生物慢，仅为原核生物的核生物的1/201/20，（约，（约50nt/50nt/秒）。秒）。3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶 真核生物真核生物DNADNA聚合酶有：聚合酶有：、e e DNA DNA聚合酶聚合酶：负责染色体负责染色体DNADNA的
35、复制。该酶的复制。该酶大亚基负责聚合，小亚基负责引物的合成，大亚基负责聚合，小亚基负责引物的合成，由于缺乏由于缺乏3-53-5的外切活性，可能参与滞后链的外切活性，可能参与滞后链RNARNA引物的合成。引物的合成。DNADNA聚合酶聚合酶：负责负责DNADNA链的延伸，完成复制。链的延伸，完成复制。该酶需要增殖细胞核抗原（该酶需要增殖细胞核抗原（PCNAPCNA）来协助，来协助，其主要功能类似于原核生物其主要功能类似于原核生物DNADNA聚合酶的聚合酶的亚基，形成一个环行的加子，增加亚基，形成一个环行的加子，增加DNADNA聚合聚合酶酶复制的连续性。复制的连续性。DNADNA聚合酶聚合酶：主要
36、负责核主要负责核DNADNA的修复。的修复。DNADNA聚合酶聚合酶：参与冈崎片段的修补。参与冈崎片段的修补。DNADNA聚合酶聚合酶：负责线粒体负责线粒体DNADNA的复制。的复制。哺乳动物的哺乳动物的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 (M)亚基数亚基数细胞内分布细胞内分布外切酶活性外切酶活性引物合成酶活性引物合成酶活性持续合成能力持续合成能力抑制剂抑制剂功能功能DNA聚合酶聚合酶 (I)4个个细胞核细胞核无无有有中等中等蚜肠霉素蚜肠霉素引物合成引物合成2个个线粒体线粒体3 -5 外切酶外切酶无无高高双脱氧双脱氧TTP线粒体线粒体DNA合成合成2个个细胞核细胞核3 -5 外切外切酶酶无无
37、有有PCNA时高时高蚜肠霉素蚜肠霉素核核DNA合成合成DNA聚合酶聚合酶 (III)DNA聚合酶聚合酶 (IV)1个个细胞核细胞核无无无无低低双脱氧双脱氧TTP修复修复DNA聚合酶聚合酶 e e(II)1个个细胞核细胞核3 -5 外切外切酶酶无无高高蚜肠霉素蚜肠霉素修复修复细菌和真核生物复制体的组成细菌和真核生物复制体的组成 组成组成 细菌细菌 真核生物真核生物 复制酶复制酶 DNA聚合酶聚合酶III 全酶全酶 DNA聚合酶聚合酶/进行性因子进行性因子 夹子夹子 PCNA 定位因子定位因子 复合物复合物 RFC 引物合成酶引物合成酶 DnaG DNA聚合酶聚合酶 去除引物去除引物 DNA聚合酶
38、聚合酶I和和RNase H RNase H1 和和MF（5 3 外切酶）外切酶）滞后链修复滞后链修复 DNA聚合酶聚合酶I和和 DNA连接酶连接酶 DNA聚合酶聚合酶e e和和 DNA连接酶连接酶I解螺旋酶解螺旋酶 DnaB T抗原抗原消除拓扑张力消除拓扑张力 旋转酶旋转酶 拓扑异构酶拓扑异构酶II抗原抗原单链结合单链结合 SSB RPA八、端粒酶（八、端粒酶（telomerase）DNADNA复制时，由于受复制时，由于受DNADNA聚合酶特性限制，聚合酶特性限制，子代子代DNADNA链的最后一个引物去除引物后，无链的最后一个引物去除引物后，无法填补空隙，易造成子代法填补空隙，易造成子代DNA
39、DNA链的缩短。链的缩短。这一难题是通过这一难题是通过端粒端粒（telomere)telomere)和和端粒酶端粒酶(telomerase)telomerase)的发现才得到了澄清。的发现才得到了澄清。真核线性真核线性DNADNA的末端形成一种特殊的结的末端形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成端粒构并与蛋白质结合成端粒,有许多成串的重有许多成串的重复序列，一条链富含复序列，一条链富含G G，另一条链富含另一条链富含C C，如人的端粒为：如人的端粒为：TTAGGGTTAGGG。端粒酶是一种含端粒酶是一种含RNARNA的蛋白复合物，实质上的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于是一种逆转录
40、酶，它能催化互补于RNARNA模板模板的的DNADNA片段的合成，使复制以后的线形片段的合成，使复制以后的线形DNADNA分子的末端保持不变。分子的末端保持不变。53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶 初步研究表明，人初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对解决无疑会有助于对生命衰老的认识。生命衰老的
41、认识。端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型TTGGGTGGGT35AATTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 35TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAA移位和移位和再杂交再杂交继续继续延伸延伸35TTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAA整合和整合和杂交杂交第二节第二节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 DNADNA复制过程中可能发生错配，复制过程中可能发生错配，DNADNA的重组，病毒基的重组，病毒基因的整合，常常会破坏局部因的整合，常常会破坏局部DNADNA的双螺旋结构。某些物理的
42、双螺旋结构。某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能作用于作用于DNA,DNA,造成结构的破坏，引起生物突变，甚至致死造成结构的破坏，引起生物突变，甚至致死的作用，称为的作用，称为DNADNA的损伤。的损伤。细胞对细胞对DNADNA损伤的修复损伤的修复主要有主要有以下以下5 5种类型种类型:错配错配修复修复(mismatch repair)(mismatch repair)直接修复直接修复(direct repair)(direct repair)切除修复切除修复(excision repair)(excision repair)
43、重组修复重组修复(recombination repair)(recombination repair)易错修复易错修复(error-prone repair)(error-prone repair)一错配修复一错配修复 错配修复依赖模板链提供的信息。错配修复依赖模板链提供的信息。因此、生物体必须有一个区分模板链和新因此、生物体必须有一个区分模板链和新合成链的机制，细胞往往采用甲基化的方合成链的机制，细胞往往采用甲基化的方式来为模板链加上标签。甲基化位置在式来为模板链加上标签。甲基化位置在GATCGATC序列的序列的A A上。上。Mut基因产物参与错配修复基因产物参与错配修复53ExoVII
44、or RecJExoVII or RecJ1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复活酶结合于、光复活酶结合于损伤部位损伤部位3、酶被可见光激活、酶被可见光激活4、修复后酶被释放、修复后酶被释放二、直接二、直接修复修复三、切除修复三、切除修复碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配结构缺陷结构缺陷切开切开 核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除DNA聚合酶聚合酶DNA连接连接酶酶AP核酸内切酶核酸内切酶切开切开切除切除修复修复连接连接N-糖苷酶糖苷酶(UvrABC)四、重组修复四、重组修复重组重组复制复制修复修复五、应急反应（五、应急反应（SOS）和易错修复和易错修复许多造成许多造成DNADNA
45、损伤或抑制修复的处理均能引损伤或抑制修复的处理均能引起一系列复杂的诱导反应，称为应急反应起一系列复杂的诱导反应，称为应急反应（SOS response)SOS response)。SOSSOS反应包括：反应包括：DNADNA损伤或抑制修复损伤或抑制修复 诱变效用诱变效用 细胞分裂抑制等细胞分裂抑制等SOSSOS诱导的修复反应包括：诱导的修复反应包括：避免错误的修复（避免错误的修复（error free error free repair)repair)易错修复易错修复 (error-prone repair)(error-prone repair)未诱导的细胞未诱导的细胞靶基因靶基因lexA基
46、因被基因被LexA 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏recA基因被基因被LexA 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物阻遏物)RecA(辅蛋白酶辅蛋白酶)靶基因表达靶基因表达uvrABC 等）等）lexA靶基因表达靶基因表达 但产物被分解但产物被分解recA大量表达大量表达RecA促使促使分解分解LexA诱导的细胞诱导的细胞单链单链DNAATP六、与六、与DNA修复修复有有关关的人的人类遗传类遗传疾病疾病1.1.着着色性色性干干皮病皮病 是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶（与切除修复有关的酶）传
47、。因核酸内切酶（与切除修复有关的酶）异常造成异常造成DNADNA修复障碍所致。临床以光暴露修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。部位色素增加和角化及癌变为特征。幼年发病，常有家族发病史。幼年发病，常有家族发病史。多数患者于多数患者于2020岁前因恶性肿瘤而死亡。岁前因恶性肿瘤而死亡。2.遗传遗传性大性大肠肠癌癌、结肠癌的临床特征结肠癌的临床特征错配修复相关基因的改变:MSH2,MSH6,PMS1，MLH1,MSH3,PMS2.3.与重组修复相关基因的改变 Brca 1、Brca 2 80%几率患乳腺癌几率患乳腺癌 第三节第三节 DNADNA的突变的突变 DNADNA分子中的
48、核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNADNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为异常的遗传特性，称为DNADNA的突变。它包括由于的突变。它包括由于DNADNA损伤和错配损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNADNA分子之间的交换分子之间的交换而引起的遗传重组。而引起的遗传重组。一、突变的类型一、突变的类型碱基对的置换碱基对的置换(substitution)substitution)移码突变移码突变(fram
49、eshiftframeshift mutation)mutation)碱基替换碱基替换：一个碱基对被另一碱基对替换。一个碱基对被另一碱基对替换。包括包括:转换转换(transtiontranstion)颠换颠换(transversiontransversion)。移码突变移码突变：增加或减少一个或几个碱基对。增加或减少一个或几个碱基对。DNADNA突变突变的类型的类型-T-C-G-C-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-G-A-C-A-T-G-C-转换转换野生型基因野生型基因-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-T-C-G-G-C-T
50、-G-T-A-C-G-A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(frameshift mutation)-T-C-G-C-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-T-G-A-C-A-T-G-C-插入插入-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失TA二、诱变剂的作用二、诱变剂的作用 碱基类似物碱基类似物(base analog)base analog)碱基修饰剂碱基修饰剂(base modifier)base modifier)嵌入染料嵌入染料(intercal