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1、项目一项目一从菠萝中提取菠萝蛋白酶微生物09301班第三实验小组成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙一、实验目的一、实验目的1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶；2、掌握对目的蛋白酶质量的检验；3、学习酶比活力的计算；二、实验基本原理二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55。本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将
2、酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。三、实验材料和试剂三、实验材料和试剂1、实验材料、实验材料 新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白2、实验试剂、实验试剂柠檬酸钠柠檬酸钠 维生素维生素c 单宁单宁 0.1%EDTA溶液溶液1.5%氯化钠溶液氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠氢氧化钠溶液溶液0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至至7.0）激活剂（激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸
3、钠和硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用现配现用）四、实验器材和仪器四、实验器材和仪器1、榨汁机；2、离心机；3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；4、恒温水浴锅（37）；5、试管、试管架；6、烧杯、容量瓶；7、移液管；五、实验操作方法法和步五、实验操作方法法和步骤（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎加柠檬酸钠，榨汁菠萝汁纱布过滤澄清液2000r/min，7min离心上清液沉淀物酶复合物酶复合物沉淀加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液4200r/min
4、,5min离心加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心冻存备用（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量1、标准曲线的制作 按下表操作试管号试管号12345678 标准蛋白（0.1mg/ml)00.10.20.40.60.81.00待测酶蛋白(ml)00000001.0磷酸缓冲液(ml)1.00.90.80.60.40.200考马斯亮蓝(ml)44444444吸光度A00.1150.1480.2450.3950.5250.5820.140（稀释5倍）根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量（三）菠萝蛋白酶活力的测定
5、1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；3、另取5支试管，分别对应标号、，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；4、将10支试管置于37水浴；5、然后按下表操作试管号试管号123451%酪蛋白（ml)0.20.40.60.70.86、按步骤5混匀，在37水浴下反应水浴下反应10 min;10 min;7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min;8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度9、测定结果如下试管号试管号12345吸光
6、度A0.6430.7330.8681.0191.232由于吸光度在0.20.8之间较准确，故上述数据中可以选择第三组数据进行处理计算（四）数据的处理1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528%（五）结果讨论从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导
7、致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。取新鲜干净的菠萝皮、刺、芯等出汁率达45%以上的下脚料，压榨，取汁滤除果屑。滤液添加0.025-0.05%的苯甲酸，加5%高岭土进行吸附。将高岭土吸附物用饱和碳酸钠溶液调pH6.7-7.0后，加5%氯化钠，搅拌后压滤。取滤液用盐酸调pH4.8-5.1，加硫酸铵，静置沉淀，取沉淀减压干燥，即为菠萝蛋白酶。对菠萝下脚料计，收率0.054-0.103%。生产方法 由菠萝(Ananas comoslgs和A.bracteatus)果实及茎(主要利用其外皮)经压榨提取、盐析(或丙酮、乙醇沉淀)再分离、干燥而得。