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1、第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度计分光光度计10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素10.5 光度分析法的设计光度分析法的设计10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法10.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用10.0 基础知识基础知识分析方法的分类分析方法的分类按原理分：按原理分：化学分析化学分析:以物质的化学反应为基础的分析方法以物质的化学反应为基础的分析方法 仪器分析仪器分析:以物质的物理和物理化学性质为基础的分析方法以物质的物理和物理化学性质为基础的分析方
2、法 光学分析方法：光谱法，非光谱法光学分析方法：光谱法，非光谱法 电化学分析法电化学分析法 ：伏安法，电导分析法等：伏安法，电导分析法等 色谱法：液相色谱，气相色谱，毛细管电泳色谱法：液相色谱，气相色谱，毛细管电泳 其他仪器方法：热分析其他仪器方法：热分析按分析任务：定性分析，定量分析，结构分析按分析任务：定性分析，定量分析，结构分析 按分析对象：无机分析，有机分析，生物分析，环境分析等按分析对象：无机分析，有机分析，生物分析，环境分析等 n特点特点n灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达105106mol/L,10-4%10-5%n准确度能够满足微量组分的测定要求：准确度能够满足微量组
3、分的测定要求：相对误差相对误差25（12）n操作简便快速操作简便快速n应用广泛应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。(1)(1)光光的的基本性质基本性质:电磁波的波粒二象性电磁波的波粒二象性c真空中光速真空中光速 2.99792458108m/s3.0 108m/s波长，单位：波长，单位：m,cm,mm,m,nm,1m=10-6m,1nm=10-9m,1=10-10m频率，单位：赫芝（周）频率，单位：赫芝（周）Hz 次次/秒秒 n折射率，真空中为折射率，真空中为1光的传播速
4、度光的传播速度:波动性波动性磁场向量磁场向量电场向量电场向量传播方向传播方向YZX与与物质作用物质作用光的传播示意图h h普朗克普朗克(Planck)(Planck)常数常数 6.6266.6261010-34-34J Js s 频率频率E E光量子具有的能量光量子具有的能量 单位：单位：J(J(焦耳焦耳)，eVeV(电子伏特电子伏特)光量子，具有能量光量子，具有能量。光的微粒性微粒性波粒二象性结论结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越一定波长的光具有一定的能量，波长越 长长(频率越低频率越低)，光量子的能量越低。，光量子的能量越低。单色光单色光：具有相同能量：具有相同能量(相同波长相同波长
5、)的光。的光。混合光混合光：具有不同能量：具有不同能量(不同波长不同波长)的光复合在的光复合在 一起。一起。真空中真空中:光学光谱区远紫外远紫外近紫外近紫外 可见可见近红外近红外中红外中红外 远红外远红外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm 200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m10.1 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1 吸收光谱产生的原因吸收光谱产生的原因 光光:一种电磁波一种电磁波,波粒二象性波粒二象性 光谱名称波长范围X射线0.110nm远紫外光10200nm近紫外光200400nm可见光400750nm近
6、红外光0.752.5um中红外光2.55.0um远红外光5.01000um微波0.1100cm无线电波11000m当光子的能量与分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子 E=hu u=hc/溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱/nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光不同颜色的可见光波长及其互补光吸收光
7、谱曲线：吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小物质在不同波长下吸收光的强度大小 A 关系关系最大吸收波长最大吸收波长 max：光吸收最大处的波长光吸收最大处的波长3 一些基本名词和概念一些基本名词和概念 max对比度对比度():络合物最大络合物最大吸收波长吸收波长(MRmax)与试剂最与试剂最大吸收波大吸收波(Rmax)之差之差 300400500600700/nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱的吸收光谱/nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-4
8、90绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿原子光谱为线光谱原子光谱为线光谱分子光谱为带光谱分子光谱为带光谱电子跃迁能级电子跃迁能级分子振动能级分子振动能级分子转动能级分子转动能级 4 4 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律光吸收定律朗伯光吸收定律朗伯-比尔比尔(Lambert-Beer)定律定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa T=It/I0,T:透射比或透光度透射比或
9、透光度 A=lg(I0/It)lg(1/T),A:吸光度吸光度朗伯定律（朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比年）：光吸收与溶液浓度成正比 当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系朗伯比尔定律比关系朗伯比尔定律 光吸收定律光吸收定律 数学表达：数学表达：Alg(1/T)=Kbc其中，其中，A:吸光度，吸光度，T:透射比，透射比，K:比例常数，比例常数，b:溶液厚度
10、，溶液厚度，c:溶液浓度溶液浓度注意：注意：平行单色光平行单色光 均相介质均相介质 无发射、散射或光化学反应无发射、散射或光化学反应摩尔吸光系数摩尔吸光系数 灵敏度表示方法灵敏度表示方法A=bcA=K Kbcc:mol/L 表示物质的浓度为表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为液层厚度为1cm时溶液时溶液的吸光度。的吸光度。单位：单位：(Lmol-1 cm-1)c:g/LA=abc a:吸光系数吸光系数桑德尔桑德尔(Sandell)灵敏度：灵敏度：S 当仪器检测吸光度为当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。程内所能检测到的吸光物质的最
11、低含量。单位：单位：m mg/cm2 S=M/氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30g，用2cm比色池，在650nm测定光吸收，A0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有两种做法：根据A=bC,求3.3104 Lmol-1cm-1 吸光度的加和性吸光度的加和性A1=1bc1A2=2bc2A =1bc1+2bc2 根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定某些化学反应平衡常数的测定在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各的多种物质
12、，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和个吸光物质的吸光度之和1 分光光度计的组成分光光度计的组成光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器读出系统读出系统10.3 吸光光度计吸光光度计常用光源常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185375紫外氘灯185400紫外钨灯3202500可见，近红外卤钨灯2502000紫外，可见，近红外氙灯1801000紫外、可见（荧光）能斯特灯10003500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段单色器单色器 作用作用:产生单色光产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）样品池（比色皿）厚度厚度(光
13、程光程):0.5,1,2,3,5cm 材质：玻璃比色皿可见光区材质：玻璃比色皿可见光区 石英比色皿可见、石英比色皿可见、紫外光区紫外光区检测器检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器：常用检测器：光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 光二极管阵列光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用化铯为红敏，适用6251000nm波长；阴极波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用表面涂锑和铯为紫敏，适用200625nm波长波长目视比色法目视比色法比色管比色管 光电比色法光电比色法光电比色计光
14、电比色计 光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计 分光光度法与分光光度计分光光度法与分光光度计 722型分光光度计光学系统图型分光光度计光学系统图 1.光源；光源；2.滤光片；滤光片；3,8聚光镜聚光镜4,7.狭缝；狭缝；5.准直镜；准直镜；6.光栅光栅9.比色池；比色池；10.光电管光电管 10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素要求：要求：a.选择性好选择性好b.灵敏度高灵敏度高(104)c.产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d.化学性质稳定化学性质稳定e.反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别(60nm)没有颜色的化合物，需要通
15、过适当的反应定量没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定生成有色化合物再测定 显色反应显色反应1 显色反应显色反应络合反应络合反应氧化还原反应氧化还原反应2 显色反应类型显色反应类型离子缔合反应离子缔合反应成盐反应成盐反应 褪色反应褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂偶氮胂III络合物测定草酸络合物测定草酸吸附显色反应吸附显色反应 达旦黄测定达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色吸附达旦黄呈红色 3 显色剂显色剂3 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂:过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：有机显色剂：偶氮类：偶氮胂偶氮类：偶氮胂III三苯甲
16、烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料 铬天菁铬天菁S S 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料 结晶紫结晶紫 邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 肟类：丁二肟肟类：丁二肟 混配化合物混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物离子缔合物 AuCl4-罗丹明B金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB 4 多元络合物多元络合物5 影响因素影响因素5 影响因素影响因素a 溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液）u 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变lu 影响待测离子的存在状态，防止沉淀u 影响络
17、合物组成形式形式 pH max(nm)形式形式 pH max(nm)H4L+1.2 462-465 Sn4+1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+5.0 550H2L-8.4-9.0 512HL2-11.4-12.0 532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响对苯芴酮及其络合物的颜色影响 b 显色剂的用量显色剂的用量稍过量，处于平台区稍过量，处于平台区 c 显色反应时间显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定；显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定d 显色反应温度显色反应温度加热可加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解e
18、溶剂溶剂f 干扰离子干扰离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：消除办法：提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰)选择适当波长选择适当波长 1.选择选择显色反应显色反应2.选择显色剂选择显色剂3.优化显色反应条件优化显色反应条件4.选择检测波长选择检测波长5.选择合适的浓度选择合适的浓度6.选择参比溶液选择参比溶液7.建立标准曲线建立标准曲线测量条件选择测量条件选择10.5 光度分析法的设计光度分析
19、法的设计1 测定波长选择测定波长选择1 测定波长选择测定波长选择选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性2 测定浓度控制测定浓度控制2 测定浓度控制测定浓度控制控制浓度控制浓度 吸光度吸光度A：0.20.8减少测量误差减少测量误差3 参比溶液选择参比溶液选择3 参比溶液选择参比溶液选择仪器调零仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰扣除干扰试剂空白试剂空白试样空白试样空白褪色空白褪色空白 4 标准曲线制作标准曲线制作4 标准曲线制作标准曲线制作理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓
20、度标准测定不同浓度标准溶液的吸光度溶液的吸光度AAc 作图作图10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移1 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移1 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移复合光由复合光由 1和和 2组成，对于浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时
21、线性关系向下弯曲。起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。2 物理化学因素物理化学因素非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯吸光度增加，导致线性关系上弯2 物理化学因素物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 化学反应化学反应3 吸光度测量的误差吸光度测量的误差吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀3 吸光度测量的误差吸光度测量的误差A0.434，T36.8%时，测量的相对误差最小时，测量的相对误
22、差最小A=0.20.8,T=1565%，相对误差，相对误差4%dc/c=dA/A=dT/TlnT Er=dc/c100=dA/A100=dT/TlnT100令令ST=0.01,计算计算T不同值时的不同值时的Sc/c，当，当TlnT对对T进行进行微分时，其值为零时，微分时，其值为零时，Sc/c最小，此时最小，此时T=0.368。10.7 常用的常用的吸光光度法吸光光度法1.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高解决高(低低)浓度组分浓度组分(i.e.A在在0.20.8以外以外)问问题题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分类：高
23、吸光度差示法、低吸光度差示法、精密差示吸光度法精密差示吸光度法特点：特点：以标准溶液作空白以标准溶液作空白原理：原理：A相对相对=A=bcx-bc0=b c准确度：读数标尺扩展准确度：读数标尺扩展,相对误差减少相对误差减少,c0愈愈接近接近cx,准确度提高愈显著准确度提高愈显著10.7 常用的常用的吸光光度法吸光光度法例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁为铁(II),除干扰，还原钼（除干扰，还原钼（VI）为五价，为五价，2.00mg/100ml的钼标准溶液为参比溶
24、液，用的钼标准溶液为参比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的钼的钼标准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光度标准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光度,480nm测定测定A。2.双波长吸光光度法双波长吸光光度法2.双波长吸光光度法双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰消除背景吸收的干扰 多组分同时检测多组分同时检测 原理：原理：A=A 1-A 2=（1-2）b c 波长对的选择：波长对的选择：a.等吸光度点法，等吸光度点法，b.系数倍率法系数倍率法3.导数吸光光度法导数吸光光度法选选 1为参比波长为参比波长,2为测量波长为测量波长
25、得得 A 1=x 1bcx+y 1bcy A 2=x 2bcx+y 2bcy A=A 2-A 1=(x2bcx+y 2bcy)-(x 1bcx+y 1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G,F),y 2 y 1，则上式成为则上式成为 A=(x 2-x 1）bcx A与与cx成正比成正比,可用于测定可用于测定例例,苯酚与苯酚与2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合物混合物中苯酚中苯酚(x)的双波长分光光度法测定。的双波长分光光度法测定。3.导数吸光光度法导数吸光光度法3.导数吸光光度法导数吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干扰去除背景干扰 原理：原理：dnA/d n 1
26、0.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用10.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1 测定弱酸和弱碱的离解常数测定弱酸和弱碱的离解常数 AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。HB H+B-H+B-Ka=HBpKa=pH+lg HBB-A=AHB+AB-pKa=pH+lg AB-AA-AHBlg AB-AA-AHB对对pH作图即可求得作图即可求得pKa 2 络合物组成确定络合物组成确定2 络合物组成确定络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌制备一系列含钌3.010-5 mol/L(固定不变固定不变)和不同和不同
27、浓度（小于浓度（小于12.010-5 mol/L）的的PDT溶液，按实溶液，按实验条件，验条件，485nm测定吸光度测定吸光度,作图。作图。PDT:Ru=2:1等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法固固定定M+L,改改变变M,获获得得一一系系列列吸吸光光度度值值，吸吸光光度度最最大大的的值值所所对对应应的的M与与L的的比比值值，即即获获得得M:L比值。比值。Co(III)与与3，5二氯二氯PADAT的比值为的比值为1:2平衡移动法平衡移动法平衡移动法平衡移动法固固定定M,不不断断改改变变L，以以lgMLn/M为为纵纵坐坐标标，lgL为为横横坐坐标标，作作图图，斜斜率率n即即是是络络合合物物中中L:M的的比值；纵轴上的截距比值；纵轴上的截距lgK是络合物的稳定常数。是络合物的稳定常数。lgK+nlgL=lg(MLn/M)MLn K=MLnlgK+nlgL=lgA/(Amax-A)痕量金属分析痕量金属分析临床分析临床分析食品分析食品分析3 分析应用分析应用