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1、育育种种(strain improvement)是是指指为为改改善善种种质质对对原原出发菌株出发菌株(作物作物)进行的遗传操作。进行的遗传操作。第五章微生物药物的菌种选育第五章微生物药物的菌种选育 微生物药物微生物药物菌种选育的目的：菌种选育的目的：v 提高产量提高产量v 组份优化组份优化v 新化合物的获取新化合物的获取基因突变是一切突变的内因。基因突变是一切突变的内因。任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生菌任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生菌遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产量遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产量和性质。和性质。微生物的生理条件、培养条件、发酵条
2、件等在育种微生物的生理条件、培养条件、发酵条件等在育种发面也有着重要作用。发面也有着重要作用。1945时间时间194319431943195519711977目前目前发酵单位发酵单位(U/ml)10025050085080002万万5万万510万万青霉素诱变青霉素诱变史史微生物的潜力微生物的潜力是无穷的是无穷的。我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态原生态”后生产后生产出来的，是出来的，是“人定胜天人定胜天”的结果。的结果。我们完全可以利用现有的资源，创
3、造出奇迹。我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。自自发发突突变变(spontaneous mutation)：自自然然条条件件下下,菌菌株株也也会会发发生生遗遗传传或或生生理理上上的的变变化化而而造造成成产产量量的的改改变变。突突变变有着正向和反向的差别。有着正向和反向的差别。在在无无性性繁繁殖殖的的细细菌菌中中,突突变变率率是是用用每每一一个个细细胞胞世世代代中中每每个个细细菌菌发发生生突突变变的的概概率率，即即用用一一定定数数目目的的细细菌菌在在一一次次分分裂裂过过程程中中发发生生突突变变的的次次数数表表示示,约约10-8。不不同同生生物物和和同同一生物个体的不同基因的自发突变率不同。一
4、生物个体的不同基因的自发突变率不同。自发突变自发突变因素因素:v宇宙射线宇宙射线v环境中的低浓度物质环境中的低浓度物质v温度的改变温度的改变腺腺嘌嘌呤呤(A)和和胞胞嘧嘧啶啶(C)的的第第六六位位可可以以氨氨基基或或亚亚氨氨基基形形式式出出现现，而而鸟鸟嘌嘌呤呤(G)和和胸胸腺腺嘧嘧啶啶(T)的的第第六六位位可可以以酮酮式式或或烯烯醇醇式式出出现现。平平衡衡一一般般倾倾向向与与氨氨基基和和酮酮基基配配对对，即即DNA双双链链一一般般以以AT,GC为为主。主。自发突变的机理之互变异构效应假说自发突变的机理之互变异构效应假说如果如果A以亚氨基形式出现以亚氨基形式出现，在，在DNA合成到达这一位置的
5、合成到达这一位置的瞬间，通过瞬间，通过DNA多聚酶的作用，多聚酶的作用，新合成的新合成的DNA链上的相链上的相对位置就是对位置就是C，而不是而不是T。如如T T以稀有的烯醇式形式出现，则以稀有的烯醇式形式出现，则错配错配G，而不是而不是A。诱诱变变育育种种(induced mutation):):利利用用物物理理或或化化学学诱诱变变剂剂(mutagen)处处理理均均匀匀分分散散的的微微生生物物细细胞胞群群，促促进进其其突突变变率率大大幅幅度度提提高高，然然后后设设法法采采用用简简便便、快快速速、高高效效的的筛筛选选方方法法，从从中中挑挑选选少少数数符符合合目目的的的的突突变变株株(mutant
6、)，以以供供生生产科研之用。产科研之用。步骤：出发菌株步骤：出发菌株诱变诱变初筛初筛复筛复筛放大放大获得优良变异株。获得优良变异株。诱变育种两个主要的环节：诱变诱变育种两个主要的环节：诱变(induction)、筛选、筛选(screening)经典经典(常规常规)育种育种：诱变育种诱变育种v 出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液v 诱变剂量的选择诱变剂量的选择v 诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质v 诱变剂的选择：简便有效诱变剂的选择：简便有效 1927年年,美国遗传学家缪勒美国遗传学家缪
7、勒(H.J.Muller,18901967)首次发现用首次发现用X射线照射果蝇精子射线照射果蝇精子后，后，果蝇后代发生果蝇后代发生突变的个体数大大增加。同年突变的个体数大大增加。同年,又有科学家用又有科学家用X射线和射线和g g射线照射玉米和大麦的种子射线照射玉米和大麦的种子，也得到了类似的结果。也得到了类似的结果。第二次世界大战期间第二次世界大战期间，科学家发现了第一个化学诱科学家发现了第一个化学诱变剂变剂芥子气芥子气，开辟了化学诱变的新途径。开辟了化学诱变的新途径。从此从此，利用各种物理的和化学的手段进行人工诱变利用各种物理的和化学的手段进行人工诱变的工作在世界范围内广泛开展起来。的工作在
8、世界范围内广泛开展起来。诱变处理诱变处理的兴起的兴起 高产突变株的筛选：高产突变株的筛选：化合物抗菌活性的琼脂块法化合物抗菌活性的琼脂块法 形态突变株的筛选：形态突变株的筛选：去除色素，孢子等去除色素，孢子等 自身耐药突变株的筛选：自身耐药突变株的筛选：产量越高，对自身的抗性就越强产量越高，对自身的抗性就越强 营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制 结构类似物或前体类似物的筛选：选择结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其对其抗性水平高的抗性水平高的变变株株，可解除反馈抑制，可解除反馈抑制而提高而提高产量。产量。突变株的筛选方案的设计突变株的筛选方案的设计五、根
9、据产物特点而设计实验五、根据产物特点而设计实验b-b-内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗菌内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗菌作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味着作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味着提高浓度的提高浓度的b-b-内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性，内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性，即得到了高产菌株。即得到了高产菌株。浅浅蓝蓝菌菌素素(cerulenin)通通过过抑抑制制聚聚酮酮体体的的前前体体 (也也是是脂脂肪肪酸酸前前体体)小小分分子子酸酸类类的的合合成成而而抑抑制制聚聚酮酮体体类类抗抗生生素素的的产产生生，因因此此筛筛选选在在适适
10、当当浓浓度度的的浅浅蓝蓝菌菌素素琼琼脂脂平平板板上上的的生生长长菌菌落落即即可可能能获得获得高产菌株。高产菌株。将将道道诺诺霉霉素素产产生生菌菌在在一一定定浓浓度度的的浅浅蓝蓝菌菌素素琼琼脂脂平平板板上上生生长长后后，长长出出的的菌菌落落大大多多数数因因抗抗生生素素的的生生物物合合成成被被抑抑制制而而表表现现为为无无色色，呈呈现现红红色色的的即即为为产产生生抗抗生生素素的的菌菌落落，这这样样获获得得高高产产菌菌株株的的机机率就得到提高。率就得到提高。2004年年1月月13日日，沃沃尔尔夫夫农农业业奖奖由由中中国国的的袁袁隆隆平平与与美美国国康康奈奈尔尔大大学学的的塔塔克克斯斯莱莱(Steven
11、 Tanksley)分分享享，以以表表彰彰他他们们“对对杂杂交交水水稻稻所所做做出出的的开开创创性性研研究究和和发发现现杂杂交交优优势势的的基基因因原原理理”。袁袁隆隆平平从从实实践践及及推推理理中中突突破破了了水水稻稻为为自自花花传传粉粉植植物物而而无无杂杂种种优优势势的的经经典典观观念念的的束束缚缚,成成为为继继陈陈省省身身(沃沃尔尔夫夫数数学学奖奖)及及吴健雄吴健雄(沃尔夫物理学奖沃尔夫物理学奖)之后第三个中国人。之后第三个中国人。丘成桐丘成桐,2010,2010 沃尔夫数学奖沃尔夫数学奖袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物，袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物，
12、是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的开发和理论研究方面已走到了世界的前列。开发和理论研究方面已走到了世界的前列。恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的遗传基础是什么？遗传基础是什么？这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。这种这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出
13、的。这种理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开发产生深远的影响。发产生深远的影响。菲菲律律宾宾的的国国际际水水稻稻研研究究所所已已开开发发出出的的“金金大大米米”，通通过过转转基基因因技技术术让让水水稻稻制制造造胡胡萝萝卜卜素素(维维生生素素A的的前前体体),有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏症。缺乏症。国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量，国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量，以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中，以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入
14、水稻中，大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。2005.3,英国剑桥先正达种子公司英国剑桥先正达种子公司(Syngenta Seeds)报报道了第二代转基因道了第二代转基因“金大米金大米”胡萝卜素胡萝卜素(防止失防止失明明)含量增加了含量增加了20倍。倍。”20092009年，中国颁发了具有自主知识产权的一个转植酸酶基因玉年，中国颁发了具有自主知识产权的一个转植酸酶基因玉米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次）的生产米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次）的生产应用安全证书。应用安全证书。引发公众转基因食品安全性大争论。引发公众转基因食
15、品安全性大争论。中国工程院院士范云六：转植酸酶基因玉米可以提高饲料的利中国工程院院士范云六：转植酸酶基因玉米可以提高饲料的利用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减少用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减少动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护。动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护。此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、低此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、低成本的优势。成本的优势。中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟虫中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟虫等鳞翅目害虫危害
16、，保障水稻增产，还能减少等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%80%的化学农药的化学农药用量。用量。杂交和转基因杂交和转基因杂交杂交是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太远。是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太远。这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这个，骡这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这个，骡子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是在亲本中子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。已经存在的，不同的组合造成不同的性状。转基因转基因在本质上不同在本质上不同 。以。以BT（Bacill
17、us thuringiensis产生的可产生的可抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害）为例，抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害）为例，没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。这个不是没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。这个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗传物质传递靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗传物质传递的现象，但是很少，也不可预期。的现象，但是很少，也不可预期。自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。科学地看待问题：基于科学知识，而非基于逻辑推论和有科学地看待问题：基于科学知识，
18、而非基于逻辑推论和有选择性的所谓常识选择性的所谓常识经典育种的黄金时代已经过去，现在以及未来经典育种的黄金时代已经过去，现在以及未来属于遗传工程。属于遗传工程。现代生物技术在微生物药物育种中的应用现代生物技术在微生物药物育种中的应用理性菌种选育理性菌种选育(Rational strain improvement)是指在对微生物药物的分子水平的装配、催化、调节等是指在对微生物药物的分子水平的装配、催化、调节等机理透彻了解的基础上机理透彻了解的基础上,有针对性有针对性地地进行育种研究进行育种研究。代代谢谢工工程程是是指指运运用用重重组组DNA技技术术通通过过对对微微生生物物细细胞胞内内的的酶酶、转
19、转运运和和调调节节等等功功能能进进行行操操作作以以提提高高细细胞胞活活性性的的现现代代生生物物技技术术。主主要要用用于于有有价价值值的的化化合合物物的的研研究究和和开开发发，在在能能源源、原原材材料料、治治疗疗用用品品的的研研究究和和开开发发等等方方面面也也起起着着重重要的作用。运用于药物的研发是一个新兴的领域。要的作用。运用于药物的研发是一个新兴的领域。代谢工程代谢工程(metabolic engineering)代谢工程超越了基因扩增和基因表达调控代谢工程超越了基因扩增和基因表达调控,强调在整体强调在整体水平对生物合成旁路的观察、代谢旁路的重建、热动力水平对生物合成旁路的观察、代谢旁路的重
20、建、热动力学的稳定性、代谢物转化的速率及其控制。这就将单个学的稳定性、代谢物转化的速率及其控制。这就将单个的酶反应转向了整体的代谢旁路和生物转化网络。的酶反应转向了整体的代谢旁路和生物转化网络。v 合成异源代谢产物合成异源代谢产物v 扩大底物利用范围扩大底物利用范围v 生产非天然的新物质生产非天然的新物质,如新型药物如新型药物v 降解环境有害物质降解环境有害物质v 提高微生物对环境的适应能力提高微生物对环境的适应能力 v 阻断或降低副产物的合成阻断或降低副产物的合成 v 提高代谢产物产率。提高代谢产物产率。应用领域应用领域金大米金大米 从香叶基焦磷酸到从香叶基焦磷酸到b b胡萝卜素胡萝卜素的的
21、生物合成生物合成需要需要八八氢番茄红素合成酶基因、植物八氢番茄红素脱饱氢番茄红素合成酶基因、植物八氢番茄红素脱饱和酶基因、和酶基因、胡萝卜素脱饱和酶基因和八氢番茄胡萝卜素脱饱和酶基因和八氢番茄红素环化酶基因。红素环化酶基因。Ye(2000)使用来自欧文氏菌的八氢番茄红素脱饱使用来自欧文氏菌的八氢番茄红素脱饱和酶基因（该基因能够同时承担植物八氢番茄红和酶基因（该基因能够同时承担植物八氢番茄红素脱饱和酶基因和素脱饱和酶基因和 胡萝卜素脱饱和酶基因的功胡萝卜素脱饱和酶基因的功能）替代了相应的两个基因，使得酶促反应步骤能）替代了相应的两个基因，使得酶促反应步骤由由4个减少为个减少为3个。个。Bohme
22、rt等在拟南芥中同时表达了来自细菌的分别编码等在拟南芥中同时表达了来自细菌的分别编码3-酮硫酮硫裂解酶裂解酶(3-ketothiolase)、乙酰乙酰辅酶乙酰乙酰辅酶A还原酶还原酶(acetacetyl-CoA reductase)和和PHA合成酶合成酶(PHA synthase)的三个基因，构建的三个基因，构建了了PHB的生物合成途径，使得转基因拟南芥能够大量产生本来的生物合成途径，使得转基因拟南芥能够大量产生本来没有的没有的PHB，叶片中的含量达到鲜重的，叶片中的含量达到鲜重的4%(约为干重的约为干重的40%)。Slater等在拟南芥和油菜种子中表达上述三个基因的同时增加等在拟南芥和油菜种
23、子中表达上述三个基因的同时增加了一个来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶了一个来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因，在植物中构建了新的生物合成代谢途径，使得拟南芥和基因，在植物中构建了新的生物合成代谢途径，使得拟南芥和油菜能够产生油菜能够产生3-羟基丁酸酯与羟基丁酸酯与 3-羟基戊酸酯的共聚物羟基戊酸酯的共聚物(poly 3-hydroxybutyrate-CO-3-hydroxyvalerate)。生物塑料生物塑料 代代谢谢工工程程正正被被运运用用于于涉涉及及抗抗生生素素生生物物合合成成的的代代谢谢旁旁路路的的操操纵纵。产产生生菌菌的的生生物物化化学学和和生生理
24、理学学的的知知识识也也提提供供了了直直接接改改变变代代谢谢的的合合理理基基础础。有有可可能能通通过过测测量量前前体体和和中中间间产产物物的的代代谢谢流流以以及及鉴鉴别别限限速速步步骤骤以以用用作作遗遗传传操操作作的的靶靶点点。通通过过分分析析可可将将代代谢谢流流指指向向所所需需的的代代谢谢产产物物并并消消除不必要产物的生物合成。除不必要产物的生物合成。以以模式菌株模式菌株S.lividans建立了一个代谢流分析模型，建立了一个代谢流分析模型，目目标是标是阐明次级代谢产物碳源分布的关系，对初级碳代阐明次级代谢产物碳源分布的关系，对初级碳代谢进行操作以提高其抗生素的产生谢进行操作以提高其抗生素的产
25、生。A.提高微生物药物的单位产量提高微生物药物的单位产量增增加加限限速速酶酶所所编编码码的的基基因因的的拷拷贝贝数数：增增加加限限速速酶酶的的拷拷贝贝数可能增加抗生素的产量。数可能增加抗生素的产量。S.clavuligerus中自半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸产生头孢菌素中自半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸产生头孢菌素C 自自身身抗抗性性的的增增加加意意味味着着更更多多抗抗生生素素的的生生成成，如如将将氨氨基基糖糖甙甙类类抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因 氨氨基基糖糖苷苷-6-N-乙乙酰酰转转移移酶酶基基因因转转化化至至卡卡那那霉霉素素和和新新霉霉素素产产生生菌菌，转转化化子子对对多多种种氨氨基基糖糖甙甙类
26、类抗抗生生素素的的抗抗性性增增加加，而而且且卡卡那那霉霉素素和和新新霉霉素素的的产量提高了产量提高了2-6倍。倍。引入抗性基因引入抗性基因表达放线紫红素的途径专一性调节基因表达放线紫红素的途径专一性调节基因act-orf4,基因的基因的拷贝数增加了拷贝数增加了2倍，而抗生素的产量增加了倍，而抗生素的产量增加了30-40倍。倍。调节基因的操纵调节基因的操纵 v增加正调节基因的拷贝数增加正调节基因的拷贝数v阻断负调节基因阻断负调节基因将将道诺霉素道诺霉素生物合成的调节基因生物合成的调节基因dnrR1 和和dnrR2以高拷以高拷贝的形式贝的形式转转化化至产生菌中，至产生菌中，道诺霉素道诺霉素的中间体
27、紫红霉酮的中间体紫红霉酮的合成量提高了十倍。的合成量提高了十倍。S.avermitilis可可 产产 生生 抗抗 寄寄 生生 虫虫 药药 物物 多多 组组 份份 的的 阿阿 维维 菌菌 素素(avermectin)，其其中中B1是是主主要要的的活活性性成成分分。Ikeda等等使使用用诱诱变变技技术术获获得得了了仅仅产产B组组份份(B1a,B2a,B1b,B2b)的的变变株株K2024,和和仅仅产产A组组份份(A1a,A2a,A1b,A2b)的的变变株株K2021。将将这这两两亲亲本本进进行行原生质体融合后，获得了只产原生质体融合后，获得了只产B1a和和 B2a 组份的融合株组份的融合株 K20
28、38。B.阻断代谢旁路，增加有效成分的产量或改善组份的构成阻断代谢旁路，增加有效成分的产量或改善组份的构成进一步，他们利用转座子突变技术选择性地敲除进一步，他们利用转座子突变技术选择性地敲除 S.avermitilis 中中毒性化合物寡霉素的生物合成基因，所得菌株只产生阿维菌素。毒性化合物寡霉素的生物合成基因，所得菌株只产生阿维菌素。Formation of CHC-CoA in S.collinusGenetic organization of the genes for the biosynthesis of CHC unitC.C.合理地设计产生有价值的天然产物的衍生物的生物合成旁路合理
29、地设计产生有价值的天然产物的衍生物的生物合成旁路 CHC unit is used for the biosynthesis of Doramectin不足之处不足之处l不能提供或很少提供某些产物合成所需的前体物质不能提供或很少提供某些产物合成所需的前体物质l 没有翻译后修饰没有翻译后修饰D.构建能产生中间体或前体的基因工程菌构建能产生中间体或前体的基因工程菌大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)是最常使用的表达系统是最常使用的表达系统:生长迅速生长迅速(菌体倍菌体倍增增约约为为20分钟分钟)，发酵设备简单，提取纯化容易，工艺成熟。，发酵设备简单，提取纯化容易，工艺成熟。6-dEB为为 Sac.er
30、ythraea 产生的红霉素的前体，原株产生的红霉素的前体，原株中中产量产量低低 Sac.erythraea 和和 E.coli相比较，发酵过程难以扩大化，相比较，发酵过程难以扩大化，菌体倍增时间长菌体倍增时间长(4小时小时),发酵和生产工艺需严格控制。发酵和生产工艺需严格控制。大肠杆菌系统中表达大肠杆菌系统中表达DEBS产生产生6-dEBu 如如何何表表达达正正确确折折叠叠和和翻翻译译后后修修饰饰的的PKS。催催化化表表达达产产生生6-dEB的的巨巨大大的的DEBS蛋蛋白白为为两两个个相相同同的的28个个活活性性位位点点a a2 2b b2 2g g2 2的的二二聚聚体体,有有7个个必必需需
31、磷磷酸酸泛泛酰酰乙乙胺胺化化的的残残基基。E.coli 没没有有保保证证ACP的活性的磷酸泛酰乙胺化酶。的活性的磷酸泛酰乙胺化酶。u 组成部件必需在组成部件必需在E.coli 中有供应。中有供应。6-dEB是由是由1个丙二酰个丙二酰CoA和和7个个(2S)-甲基丙二酰甲基丙二酰CoA(2S-mmCoA)作为骨架所组成的。作为骨架所组成的。E.coli 没有没有 (2S)-mm CoA。u 为为保保证证产产生生有有效效的的细细胞胞内内产产生生6-dEB的的系系统统，DEBS在在胞胞内内的的活活力力必必须须与与前前体体的的生生物物合合成成相相适适应应,以以对对相相关关的的立立体体化化学学和和动动力
32、学参数进行最优化。力学参数进行最优化。产产6-dEB的的工程菌工程菌E.coli BAP1的构建的构建基基 因因来来 源源备注备注Three DEBS genesSac.erythraea插入插入Sfp(phosphopantetheinyl transferase)B.subtilis插入插入Propionyl-CoA carboxylaseS.coelicolor插入插入prpRBCD genes(丙酸代谢丙酸代谢)内源内源删除删除prpE,birA genes(丙酸丙酸-mmCoA)内源内源超超表达表达编码编码6dEB合成酶的质粒图合成酶的质粒图6-dEB的产量已达到红霉素工业菌株的生产
33、水平的产量已达到红霉素工业菌株的生产水平本实验的成功是生物学诸多技术的综合，它包含了对本实验的成功是生物学诸多技术的综合，它包含了对6-dEB分子水平的催化，对分子水平的催化，对E.coli 基因组和生理功能的了基因组和生理功能的了解等，强调解等，强调了了学科交叉的重要性。学科交叉的重要性。抗抗生生素素的的产产生生菌菌大大多多是是好好氧氧的的，因因此此为为保保证证其其生生长长和和有有效效地地产产生生抗抗生生素素，必必须须保保证证氧氧气气的的充充足足供供应应。在在大大规规模模的的发发酵酵种种，常常需需要要不不断断地地添添加加氧氧气气以以满满足足细细胞胞生生长长和和代代谢谢。然然而而在在培培养养基
34、基中中，氧氧气气的的溶溶解解度度低低。工工业业上上常常通通过过改改良良生生物物反反应应器器(如如改改变变搅搅拌拌浆浆的的形形状状，增增加加档档板板和和搅搅拌拌功功率率）或或增增加通气量，但这些设备的要求高，能耗大。加通气量，但这些设备的要求高，能耗大。E.引入异源基因，改善培养和生产工艺引入异源基因，改善培养和生产工艺血红蛋白基因在放线菌中的应用血红蛋白基因在放线菌中的应用 将从透明颤菌中考虑的血红蛋白基因将从透明颤菌中考虑的血红蛋白基因(vhb)转至天蓝转至天蓝色链霉菌发现，菌体可在限氧的条件下生长，而且其色链霉菌发现，菌体可在限氧的条件下生长，而且其中放线紫红素的产量增加了十倍。中放线紫红
35、素的产量增加了十倍。vhb在在Sac.erythraea中表达，可将红霉素的产量提高中表达，可将红霉素的产量提高60%。将将vhb基因转至头孢菌素产生菌中，不仅提高了工程菌对基因转至头孢菌素产生菌中，不仅提高了工程菌对氧气的利用量，而且大幅度提高了抗生素的产量。氧气的利用量，而且大幅度提高了抗生素的产量。在好氧菌透明颤菌中发现血红蛋白为在好氧菌透明颤菌中发现血红蛋白为氧气氧气携带者，能促携带者，能促进氧气扩散到细胞末端的氧化酶上，进氧气扩散到细胞末端的氧化酶上，这这使得细胞在缺氧使得细胞在缺氧状态下也可能良好生长。状态下也可能良好生长。以以DNA改组为代表的体外定向进化改组为代表的体外定向进化
36、(directed evolution)定向进化定向进化不需事先了解酶的空间结构和催化机制不需事先了解酶的空间结构和催化机制,通过通过模拟自然进化机制模拟自然进化机制,以改进的诱变技术结合确定进化方以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶。短期内可以在试管中完成自然界需要几的非天然酶。短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，是发现新型酶和新的生理生化反百万年的进化过程，是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径。应的重要途径。目的：增加酶的底物专一性、立体选择性、比活、稳定目的：增加酶的底物专
37、一性、立体选择性、比活、稳定性、溶剂耐受性、增加性、溶剂耐受性、增加pH H范围，以及这些特性的组合。范围，以及这些特性的组合。The fundamental rule of directed evolution is you get what you screen forFrancis Arnold定定向向进进化化的的根根本本规规则则是是获获得得你你希希望望通通过过筛筛选选得得到到的的突变体突变体在在待待进进化化酶酶基基因因的的PCR扩扩增增反反应应中中,利利用用Taq DNA多多聚聚酶酶不不具具有有35校校对对功功能能的的性性质质,配配合合适适当当条条件件,以以很很低低的的比比率率向向目目
38、的的基基因因中中随随机机引引入入突突变变,构构建建突突变变库库,凭凭借借定定向向的的选选择择方方法法,选选出出所所需需性性质质的的优优化化酶酶,从从而而排排除除其其他他突突变变体。体。定向进化的一般原理定向进化的一般原理在定向进化中在定向进化中,尽管突变具有随机性尽管突变具有随机性，但通过但通过选择特定选择特定方向的突变限定了进化趋势方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件加之控制实验条件，限定限定突变种类突变种类，降低突变率降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度速度。定向
39、进化定向进化 =随机突变随机突变 +选择选择 与自然进化不同与自然进化不同,定向进化是人为引发的，整个进化定向进化是人为引发的，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。过程完全是在人为控制下进行的。DNANA改组改组(DNA Shuffling)原理原理项目项目进化速度进化速度进化对象进化对象进化进化周期周期影响对象影响对象突变效率突变效率常规定常规定向进化向进化缓慢进化缓慢进化整个基因组整个基因组多年多年完整基因组完整基因组高高DNAShuffling快速进化快速进化特定基因特定基因/操纵子操纵子/病病毒毒几天几天部分基因组部分基因组低低DNA Shuffling 与常规定向进化的比较与常规定
40、向进化的比较v 错误倾向性错误倾向性PCR(Error-prone PCR)v 外显子改组外显子改组(Exon shuffling)v 点饱和突变点饱和突变 (Saturation mutagenesis)v 体外随机引发重组体外随机引发重组(Random priming in vitro recombination)v 交错延伸交错延伸(Staggered extension process)v 区域化自我复制区域化自我复制(Compartmentalized self replication)v 体外随机定位诱变体外随机定位诱变 (Random site-directed mutagene
41、sis)部分部分类似的类似的和和发展发展的的方法方法酶酶性质性质突变方法突变方法枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E有机相活性有机相活性/稳定性稳定性易错易错PCR-内酰胺酶内酰胺酶总活力总活力/底物专一性底物专一性DNA改组改组枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性稳定性盒式诱变盒式诱变对硝基苯酯酶对硝基苯酯酶底物专一性底物专一性/有机相活性有机相活性易错易错PCR/DNA改组改组胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性底物专一性盒式诱变盒式诱变-半乳糖苷酶半乳糖苷酶底物专一性底物专一性DNA改组改组绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光荧光DNA改组改组核酶核酶底物专一性底物专一性易错易错PCR/DN
42、A改组改组天冬氨酸酶天冬氨酸酶活性与稳定性活性与稳定性随机随机/定位诱变定位诱变药物和疫苗药物和疫苗活性活性/专一性专一性/最佳表达最佳表达DNA改组改组酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例 改改组组的的酶酶库库较较天天然然酶酶的的一一个个优优势势在在于于前前者者可可能能含含有有后后者者经经天天然然选选择择压压力力所所不不能能表表现现出出来来的的一一些些特特性性(或或特特性性的的综综合合)。如如对对有有着着很很高高商商业业价价值值的的 Savinase 酶酶进进行行改改组组时时，挑挑取取了了654个个克克隆隆研研究究如如pH、热热稳稳定定性性、溶溶剂剂稳稳定定性性等等特特征征。发发
43、现现12%的克隆在所有检测的特征中均有提高。的克隆在所有检测的特征中均有提高。值得一提的是，有的克隆表现出了原株没有的特点。同时值得一提的是，有的克隆表现出了原株没有的特点。同时发现，热稳定性最佳的的嵌合株与其他的相比，在序列上发现，热稳定性最佳的的嵌合株与其他的相比，在序列上并不比与起始的热稳定株更近。这提示根据酶的序列来选并不比与起始的热稳定株更近。这提示根据酶的序列来选择起始改组的材料时必须慎重。择起始改组的材料时必须慎重。v选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点v建立有效且灵敏的选择方法建立有效且灵敏的选择方法，确保检测出功能变化确保检测出功能变化
44、关键点：关键点：与与DNA改改组组相相同同，全全基基因因组组改改组组是是美美国国Maxygen 公公司司(DNA改改组组发发明明人人W.P.C.Stemmer为为CEO)开开发发的一种新的菌株育种技术。的一种新的菌株育种技术。全基因组改组全基因组改组(Whole Genome Shuffling)全全基基因因组组改改组组可可以以说说是是经经典典的的原原生生质质体体融融合合基基础础上上的的一一个个突突破破。与与原原生生质质体体融融合合的的重重复复操操作作不不同同，全全基基因因组组改改组组是是在在第第一一轮轮诱诱变变后后，选选取取多多个个而而非非单单个个高高活活性性的菌株进行原生质体融合。后面的几
45、轮也如法炮制。的菌株进行原生质体融合。后面的几轮也如法炮制。这这样样,全全基基因因组组改改组组是是有有性性的的重重复复重重组组(Sexual recursive recombination),而而非非简简单单原原生生质质体体融融合合的的无无性重复突变性重复突变(Asexual recursive mutagenesis)。Asexual vs.sexual evolution全基因组改组与经典原生质体融合的比较全基因组改组与经典原生质体融合的比较:泰洛菌素产量提高泰洛菌素产量提高实验。研究发现一年、四轮、实验。研究发现一年、四轮、24,000次全基因组改组就达到了次全基因组改组就达到了20年、
46、年、106次经典的育种方法次经典的育种方法(化学突变和筛选化学突变和筛选)的效果。的效果。一一个个菌菌种种选选育育的的新新纪纪元元正正在在出出现现，其其中中基基因因组组学学、蛋蛋白白质质组组学学、代代谢谢组组学学已已经经用用来来阐阐述述基基因因和和代代谢谢旁旁路路的的相相互互作作用用。尽尽管管传传统统的的、经经验验的的方方法法如如随随机机诱诱变变和和选选择择等等仍仍然然是是非非常常有有效效的的(虽虽然然它它们们很很费费时时)，基基因因组组学学可可运运用用更更加加直直接接，理理性性的的方方法法用用来来减减少少不不必必要要、有有害害突变的引入。突变的引入。基因组在应用于发酵过程来获得高产率、为得到
47、新的基因组在应用于发酵过程来获得高产率、为得到新的化合物而创造新的旁路、提高产生菌的细胞生长和发化合物而创造新的旁路、提高产生菌的细胞生长和发酵的能力等方面有着巨大的潜力。酵的能力等方面有着巨大的潜力。v经典诱变经典诱变 手段成熟，有许多成功的经验可以借鉴。手段成熟，有许多成功的经验可以借鉴。染色体的随机突变，筛选量大，效率低，可逆性强，染色体的随机突变，筛选量大，效率低，可逆性强，周期长，分子水平的机理不清周期长，分子水平的机理不清楚楚。v现代生物技术现代生物技术 基因水平的定向突变，目标明确，可设计，基因水平的定向突变，目标明确，可设计，机理清晰，筛选量少。机理清晰，筛选量少。仍处于发展时期。仍处于发展时期。经典诱变与理性菌种选育的比较经典诱变与理性菌种选育的比较