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1、在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确5 5 蛋白质蛋白质定性定量分析及保存定性定量分析及保存在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确 蛋白质定性分析蛋白质定性分析(qualitative analysis)确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在确
2、定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质的是何种蛋白质 蛋白质定量分析蛋白质定量分析(quantitative analysis)确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量白成分的含量在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确 蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定方法 蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定 纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存 蛋白质
3、的免疫印迹分析蛋白质的免疫印迹分析(western blotting)蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究常见方法在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确第一节第一节 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
4、目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量分析样品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是最常用的蛋白定量方法是比色法比色法，包括，包括Bradford（考马斯亮蓝）、（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外法、紫外分光光度法等。分光光度法等。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
5、蛋白质的蛋白质的比色法比色法含量测定含量测定基于蛋白质的基于蛋白质的元素组成特点元素组成特点基于蛋白质的基于蛋白质的化学显色反应化学显色反应基于蛋白质的基于蛋白质的光吸收特性光吸收特性在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确一、基于一、基于蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点 -凯氏定氮法凯氏定氮法各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此由于体内的含氮物
6、质以蛋白质为主，因此只只要要测测定定生生物物样样品品中中的的含含氮氮量量，就就可可以以根根据据以下公式推算出蛋白质的大致含量：以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确凯氏定氮法凯氏定氮法18831883年，丹麦化学家年，丹麦化学家年，丹麦化学家年，丹麦化学家KjeldahlKje
7、ldahl建立，基于蛋白质的建立，基于蛋白质的建立，基于蛋白质的建立，基于蛋白质的含氮量在含氮量在含氮量在含氮量在16%16%左右。左右。左右。左右。蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质+硫酸硫酸硫酸硫酸COCO2 2+H+H2 2O+NHO+NH3 3硫酸铵硫酸铵硫酸铵硫酸铵+强碱强碱强碱强碱氨氨氨氨优点：适用样品广泛，结果可靠优点：适用样品广泛，结果可靠优点：适用样品广泛，结果可靠优点：适用样品广泛，结果可靠缺点：样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基缺点：样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基缺点：样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基缺点：样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基酸有偏差时（大量碱性
8、氨基酸、酰胺、小分子量氨酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）误差较大；操作繁琐。基酸）误差较大；操作繁琐。基酸）误差较大；操作繁琐。基酸）误差较大；操作繁琐。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确二、基于蛋白质的光吸收特性二、基于蛋白质的光吸收特性 -紫外光谱紫外光谱(A280)吸收法吸收法 这一方法可用来快速检测溶液
9、中是否含有这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰。白质的洗脱峰。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确原原 理理芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收蛋白质中的蛋白质中的蛋白质中的蛋白质中的TrpTrp、TyrTyr在在在在280nm280nm有特征性吸收；肽键有特征性吸收；肽键有特征性吸收；肽键有特征性吸收；肽键在在在在215
10、nm215nm附近有特异吸收。附近有特异吸收。附近有特异吸收。附近有特异吸收。可通过测定该波长的光吸收可通过测定该波长的光吸收可通过测定该波长的光吸收可通过测定该波长的光吸收度，计算蛋白质浓度。度，计算蛋白质浓度。度，计算蛋白质浓度。度，计算蛋白质浓度。C CA/KLA/KL，其中，其中，其中，其中A A为吸光为吸光为吸光为吸光度，度，度，度，KK为摩尔消光系数，为摩尔消光系数，为摩尔消光系数，为摩尔消光系数，L L为光程。为光程。为光程。为光程。KK值可通过各种方值可通过各种方值可通过各种方值可通过各种方法得到（包括软件分析等）。法得到（包括软件分析等）。法得到（包括软件分析等）。法得到（包
11、括软件分析等）。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确所需时间所需时间 几分钟几分钟优优 点点 快速快速缺缺 点点 核酸可引起强干扰作用核酸可引起强干扰作用灵灵 敏敏 度度 0.2 mg/ml2 mg/ml 对蛋白质无破坏性对蛋白质无破坏性 不是严格的定量，适用于测定蛋不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液白质粗提液 在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题
12、也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法 蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74-0.74A260注意事项注意事项 石英比色杯石英比色杯 调零所用溶液调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液配制标准蛋白所用溶液 光密度范围光密度范围在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确二、二、Bradfo
13、rd检测法检测法由由Bradford等人于等人于1976年建立年建立 这是一种迅速、可靠的通过染色法测这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法定溶液中蛋白质含量的方法目前绝大多数公司都提供基于此原理目前绝大多数公司都提供基于此原理的蛋白质定量试剂盒的蛋白质定量试剂盒基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的化学显色反应在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确原原 理理 该法是基于考马斯亮蓝该法是基于考马斯亮蓝G
14、-250有红、蓝两种有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光的光吸收值大小计算蛋白的含量吸收值大小计算蛋白的含量在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课
15、的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确所需时间所需时间 10 min优优 点点 快速（反应时间仅需快速（反应时间仅需2 min）敏感，几乎没有蛋白质损失敏感，几乎没有蛋白质损失缺缺 点点 用这种测定方法对蛋白质引起不用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性可逆的变性灵灵 敏敏 度度 25 ug/ml200 ug/ml 对各种纯化蛋白质反应不同对各种纯化蛋白质反应不同在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置
16、具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 标准曲线在标准曲线在2.5 ug15 ug BSA浓度浓度 范围内保持线性关系范围内保持线性关系 反应反应1015 min后开始出现沉淀，后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀件下易发生沉淀 若选用目的蛋白来做标准曲线或用若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确较准确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课
17、的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确三、三、Lowry检测法检测法 1951年年Lowry在在Folin酚试剂法和双缩脲酚试剂法和双缩脲法的基础上建立法的基础上建立这一标准、快速的蛋白质定量检测方法这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除质沉淀将干扰物质去除基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的化学显色反应在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带
18、着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确原原 理理 首先在碱性溶液中形成铜首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂磷钨酸试剂(Folin-酚试剂酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大处有最大的吸收峰，颜色的深浅的吸收峰，颜色的深浅(吸收值吸收值)与蛋白质浓度与蛋白质浓度成正比，可根据成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算的光吸收值大小计算蛋白质的含量蛋白质的含量在整堂课的教学中，刘教师总是让
19、学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确所需时间所需时间 40 min优优 点点 一种可靠的蛋白质定量方法一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小不同蛋白质之间差别很小缺缺 点点 某些试剂不稳定某些试剂不稳定灵灵 敏敏 度度 5 ug/ml100 ug/ml 干扰物质多干扰物质多 反应速度慢反应速度慢 使蛋白质发生不可逆变性使蛋白质发生不可逆变性在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问
20、题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 在加入试剂在加入试剂30 min后呈色达到饱后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱和，时间延长颜色信号减弱 许多干扰物质降低颜色反应许多干扰物质降低颜色反应 高盐浓度可引起沉淀高盐浓度可引起沉淀在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确四、四、BCA(
21、二喹啉甲酸二喹啉甲酸)检测法检测法 这是近年来新研制的一种改进的这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响，有试剂盒出售。有干扰物质的影响，有试剂盒出售。基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的化学显色反应在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确原原 理理 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将生成络合物，同
22、时将Cu2还原成还原成Cu。而而BCA试剂可敏感特异地与试剂可敏感特异地与Cu结合，形成稳结合，形成稳定的有颜色的复合物，在定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确优优 点点 与与Lowry法相比几乎没有干扰物质的法相
23、比几乎没有干扰物质的 影响影响缺缺 点点 蛋白质发生不可逆的变性蛋白质发生不可逆的变性灵灵 敏敏 度度 标准检测：标准检测：10 1200 ug/ml 单一试剂单一试剂 终产物稳定终产物稳定 反应时间长反应时间长 微量检测：微量检测：0.5 10 ug/ml在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 与与Lowry相比，采用相比，采用BCA法时，法时，如果样品中含有脂类
24、物质将明显如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值提高光吸收值 为促进为促进BCA法的反应进程，可将法的反应进程，可将 样品适当加热样品适当加热在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确其它蛋白质的定性定量方法其它蛋白质的定性定量方法1.蛋白质的染色定量蛋白质的染色定量2.ELISA测定测定3.放射免疫测定放射免疫测定在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很
25、明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确第二节第二节 蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定分子量测定分子量测定(molecular weight,MW)排阻层析排阻层析沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心动态弹性光散射动态弹性光散射孔径梯度电泳孔径梯度电泳质谱质谱(ESI-MS)在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确1.SDS-PAGE测定分子量测
26、定分子量v基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：SDSSDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢可以破坏蛋白质中的疏水键和氢可以破坏蛋白质中的疏水键和氢可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（键，并按一定比例（键，并按一定比例（键，并按一定比例（1g1g蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合1.4g SDS1.4g SDS）和）和）和）和蛋白质组成复合物，使蛋白质组成复合物，使蛋白质组成复合物，使蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷蛋白质带的负电荷蛋白质带的负电荷蛋白质带的负电荷的量远的量远的量远的量远远超过其本身的电荷量，并远超过其本身的电荷量，并远超过其本身的电荷量，并远超过其本身的电荷
27、量，并与蛋白质的分子量成与蛋白质的分子量成与蛋白质的分子量成与蛋白质的分子量成正比正比正比正比。v2-2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其圆棒形，其圆棒形，其圆棒形，其轴长与分子量成正比轴长与分子量成正比轴长与分子量成正比轴长与分子量成正比。v q/fq/fq q/6/6 r r ，所有蛋白质的迁移率都相同所有蛋白质的迁移率都相同所有蛋白质的迁移率都相同所有蛋白质的迁移率都相同。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由
28、浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确v在在在在SDS-PAGESDS-PAGE中迁移的蛋白质的分子量与电泳中迁移的蛋白质的分子量与电泳中迁移的蛋白质的分子量与电泳中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式：迁移率的关系符合下述公式：迁移率的关系符合下述公式：迁移率的关系符合下述公式：lg lg MMr rlglgK KbmbmK K1 1bmbm其中其中其中其中MMr r为蛋白质相对分子量，为蛋白质相对分子量，为蛋白质相对分子量，为蛋白质相对分子量，K K、K K1 1为常数，为常数，
29、为常数，为常数，b b为为为为斜率，斜率，斜率，斜率，mm为迁移率。为迁移率。为迁移率。为迁移率。注意：注意：注意：注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在
30、整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在半对数坐标纸上做出标准曲线在半对数坐标纸上做出标准曲线注意：标准曲线注意：标准曲线注意：标准曲线注意：标准曲线的斜率会根据所的斜率会根据所的斜率会根据所的斜率会根据所用凝胶浓度而发用凝胶浓度而发用凝胶浓度而发用凝胶浓度而发生微小的改变。生微小的改变。生微小的改变。生微小的改变。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明
31、确2.凝胶过滤层析法测定分子量凝胶过滤层析法测定分子量v蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积V Ve e，与其，与其，与其，与其分子量的关系如下式所示：分子量的关系如下式所示：分子量的关系如下式所示：分子量的关系如下式所示：lg lg MMr rK K1 1K K2 2 V Ve ev在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的V Ve e，并以它们的，并以它们的，并以它们
32、的，并以它们的lg lg MMr r对对对对V Ve e作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出样品的样品的样品的样品的V Ve e，即可从图中得到样品的分子量。，即可从图中得到样品的分子量。，即可从图中得到样品的分子量。，即可从图中得到样品的分子量。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的与凝胶过滤法是互补的v凝胶过滤法测得的是蛋白质凝胶过滤法
33、测得的是蛋白质凝胶过滤法测得的是蛋白质凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构四级结构四级结构四级结构（如果它有（如果它有（如果它有（如果它有的话）的分子量；的话）的分子量；的话）的分子量；的话）的分子量；vSDS-PAGESDS-PAGE测得的是蛋白质测得的是蛋白质测得的是蛋白质测得的是蛋白质亚基亚基亚基亚基的分子量；的分子量；的分子量；的分子量；v在有在有在有在有2-2-巯基乙醇（或巯基乙醇（或巯基乙醇（或巯基乙醇（或DTTDTT）存在时，）存在时，）存在时，）存在时，SDS-PAGESDS-PAGE可测得蛋白质每条多肽链的分子量。可测得蛋白质每条多肽链的分子量。可测得蛋白质每条多肽链的分子量。可
34、测得蛋白质每条多肽链的分子量。v综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。许多信息。许多信息。许多信息。例如：例如：例如：例如：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD180kD SDS-PAGE SDS-PAGE（不加还原剂）结果：（不加还原剂）结果：（不加还原剂）结果：（不加还原剂）结果：45kD45kD SDS-PAGE SDS-PAGE（加还原剂）结果：两条蛋白带
35、（加还原剂）结果：两条蛋白带（加还原剂）结果：两条蛋白带（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD15kD和和和和30kD30kD）则结论是：则结论是：则结论是：则结论是：该蛋白质由该蛋白质由该蛋白质由该蛋白质由4 4个相同的亚基个相同的亚基个相同的亚基个相同的亚基组成，每个亚基由组成，每个亚基由组成，每个亚基由组成，每个亚基由两条多肽链两条多肽链两条多肽链两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为的分子量分别为的分子量分别为的分子量分别为15kD15kD和和和和30kD30kD。在整堂课的教学中，刘教师
36、总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确3.质谱法是质谱法是最精确最精确的分子量测定方法的分子量测定方法v质谱（质谱（质谱（质谱（Mass SpectrometryMass Spectrometry，MSMS）是带电原子、）是带电原子、）是带电原子、）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（分子或分子碎片按质荷比（分子或分子碎片按质荷比（分子或分子碎片按质荷比（mm/z z）的大小顺序排列）的大小顺序排列）的大小顺序排列）的大小顺序排列的图谱。的图
37、谱。的图谱。的图谱。v由于由于由于由于ESIESI和和和和MALDIMALDI两大电离技术的出现，质谱技两大电离技术的出现，质谱技两大电离技术的出现，质谱技两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度子量测定。精确度子量测定。精确度子量测定。精确度0.010.010.10.1。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习
38、，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确第三节第三节 纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确一、一、蛋白质的浓缩蛋白质的浓缩1.超滤法超滤法超滤法超滤法使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。的技术。的
39、技术。的技术。常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。膜内。膜内。膜内。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的
40、在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。技术，保持蛋白质构象的最好方法。技术，保持蛋白质构象的最好方法。技术，保持蛋白质构象的最好方法。注意：必须保证蛋白质始终处于注意：必须保证蛋白质始终处于注意：必须保证蛋白质始终处于注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态冷冻状态冷冻状态冷冻状态（在（在（在（在7070冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。（右旋糖酐、甘露醇等）。（右旋糖酐、甘露醇等）。（右旋糖酐、甘露醇等）。在整堂课的教学中，刘教师总是让
41、学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确3.吸收法吸收法吸收法吸收法采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEGPEG、蔗糖、凝胶干粉等。蔗糖、凝胶干粉等。蔗糖、凝胶干粉等。蔗糖、凝胶干粉等。4.沉淀法沉淀法沉淀法沉淀法硫酸铵、硫酸铵、硫酸铵、硫酸铵、PEGPEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。、有机
42、溶剂沉淀；免疫沉淀。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确5.其它方法其它方法v浓缩胶浓缩法浓缩胶浓缩法v离子交换法离子交换法v吸附法吸附法v蒸发法蒸发法在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确二、二、蛋白质的干燥蛋白质的干燥v常压吸收干燥常压吸
43、收干燥v真空干燥真空干燥v冷冻干燥冷冻干燥v喷雾干燥喷雾干燥v气流干燥气流干燥在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确三、三、蛋白质的保存蛋白质的保存1.影响蛋白质成品保存的因素：影响蛋白质成品保存的因素：1）空气）空气 2）湿度）湿度 3）水分）水分 4）光线）光线 5）pH值值 6）时间）时间在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，
44、刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.蛋白质的保存方法蛋白质的保存方法v低温下保存低温下保存v制成干粉或结晶保存制成干粉或结晶保存v在保护剂下保存在保护剂下保存 a.惰性的生化或有机物惰性的生化或有机物 b.中性盐中性盐 c.巯基试剂巯基试剂在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确第四节第四节 蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究常见方法在整堂课的教学中，刘
45、教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究常见方法1 1：常规双向电泳：常规双向电泳2 2：DIGEDIGE3 3：1515N N等同位素标记等同位素标记4 4：ICATICAT5 5：iTRAQiTRAQ6 6：SILACSILAC在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设
46、置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确1 1：双向电泳：双向电泳 基于基于2D-PAGE2D-PAGE的经典定量分的经典定量分析方法。析方法。1 1、样品准备、样品准备和定量：和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。2 2、蛋白质分、蛋白质分离：离：蛋白质经过2D-PAGE分离后染色（银染、考染等）。3、蛋白质的、蛋白质的定性与定量分定性与定量分析：析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明
47、确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2 2：DIGEDIGE简介：简介：DIGE 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2,Cy3,Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。技术优势：技术优势：1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量；2：与常规银染相比灵敏度更高；3：检测动态范围更大；4：定量精确,采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差；5：统计学分析，ImageMast
48、er7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2 2：DIGEDIGE DIGEDIGE荧光定量方法流程图荧光定量方法流程图.1 1、样品准备、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。2 2、蛋白质分离：、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-P
49、AGE电泳分离，荧光显色。3 3、蛋白质定量分析：、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确3 3：代谢标记法：代谢标记法1515N N标记法标记法简介：简介：在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。根据质谱谱图
50、中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。优点：优点：高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%；重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；灵活性：在培养基中添加同位素标记15N，操作方便。缺点：缺点：（1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。（2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确在