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1、植植物物细胞培养制胞培养制药意意义药用植物是天然用植物是天然药物的宝物的宝库植物植物细胞培养是生胞培养是生产的的药物可能途径物可能途径目前采用植物目前采用植物细胞培养生胞培养生产的的药物主要包括物主要包括 （1 1）苷苷（甙）类：包包括括皂皂苷苷（人人参参皂皂苷苷、三三七七皂皂苷苷、柴柴胡胡皂皂苷苷、著著芋芋皂皂苷苷等等）、强心心苷苷（强心心醇醇苷苷、毛毛地地黄毒配黄毒配质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2 2）甾甾醇醇：包包括括菜菜油油甾甾醇醇、豆豆甾甾醇醇、谷谷甾甾醇醇、胆胆甾甾醇、异岩藻甾醇等。醇、异岩藻甾醇等。1.强心苷类（侧链为不饱和内酯环）甾醇
2、甾醇2.（3 3）生物碱：吡）生物碱：吡啶、喹啉、异啉、异喹啉等。啉等。（4 4）醌类：包括蒽：包括蒽醌、萘醌等。等。（5 5）蛋蛋白白质类：胰胰岛素素、氨氨基基酸酸、蛋蛋白白酶抑抑制制剂。植物病毒抑制。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。、植物抗生素等。（6 6）黄黄酮类：具具有有C6-C3-C6C6-C3-C6结构构，生生物物合合成成前前体体是是苯苯丙丙氨氨酸酸和和丙丙二二酸酸单酰辅酶A A。多多为治理心血管疾病和高血治理心血管疾病和高血压的的药物成分。物成分。小檗碱小檗碱蒽蒽醌黄黄酮3.植植物物细胞培养制胞培养制药进展展第一个第一个专利：利：19561956年年RoutinRoutin和和Ni
3、ckellNickell首次数提出首次数提出利用植物利用植物细胞培养技胞培养技术生生产天然天然产物的第一个物的第一个专利利 工工业植物生物技植物生物技术 ：2020世世纪9090年代明确提出年代明确提出 已已经从从 200200余种余种药用植物用植物获得了愈得了愈伤组织或或细胞胞悬浮培养物（傅浮培养物（傅经国等，国等，20042004）国国际日本日本 ：紫草：紫草 人参人参 红豆杉豆杉 欧美欧美 ：美国：美国红豆杉；豆杉；德国德国紫紫锥菊菊国内：国内：罗士士韦 叶和春叶和春 郑光植光植 侯嵩生侯嵩生 丁家宜丁家宜 4.技技术路路线 目目标植物植物选择愈愈伤组织诱导液液体体培培养养培培养养条条件
4、的件的优化化反反应器器扩大培养大培养愈愈伤组织诱导固固体体、液液体体培培养养高高产细胞系胞系筛选生物合成途径的研究生物合成途径的研究器器官官分分化化（发状状根根）固固体体液液体体培培养养条条件件的的优化化反反应器器扩大大培培养养有有效效成分提取、分离成分提取、分离5.植物植物细胞培养胞培养 是指在离体条件是指在离体条件下，将愈下，将愈伤组织或其它易分散的或其它易分散的组织置于液体培置于液体培养基中养基中进行振行振荡培养，得到分散培养，得到分散成游离的成游离的悬浮浮细胞，通胞，通过继代培代培养增殖，养增殖，获得大得大量量细胞的一种技胞的一种技术。6.植物细胞培养的特点:大小大小;细胞胞团的形式存
5、在的形式存在;纤维素素细胞壁和大液泡胞壁和大液泡,易被剪切力易被剪切力损伤;生生长缓慢慢培养基成分丰富而复培养基成分丰富而复杂,易被微生物易被微生物污染染;需光需光氧氧二氧化碳二氧化碳7.培养培养类型型按培养按培养对象来象来说，可分，可分为原生原生质体培养和体培养和单细胞培养；胞培养；按培养基按培养基类型可分型可分为固体培养和液体培养；固体培养和液体培养；按培养方式可分按培养方式可分为悬浮浮细胞培养和固定化胞培养和固定化细胞培养胞培养 。8.植物单细胞分离和初步培养单细胞胞获得：得：机械法；机械法；酶解法；愈解法；愈伤组织法法单细胞培养：胞培养：看看护培养法（培养法（nursing cultu
6、re)饲养养层培养培养(feeding layer culture)9.固体培养固体培养固体培养是在培养基中加入一定量的凝固固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加加热溶解后，分溶解后，分别装人培养用的容装人培养用的容器中，冷却后凝器中，冷却后凝结成固体培养基。成固体培养基。优缺点缺点简便易行、所占空便易行、所占空间小小 生生长的不平衡，易出的不平衡，易出现了极化了极化现象象 易堆易堆积生生长过程中排出的有害物程中排出的有害物质 有些生理生化指有些生理生化指标测定不方便定不方便常用的固化常用的固化剂 琼脂、明胶（脂、明胶（10%10%）等）等10.液体培养液体培养 1 1成批培养法成批培养
7、法 batch culturebatch culture细胞和培养基一次性加入到培养容器或生胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反物反应器内器内进行培养行培养,在培养在培养过程中培养液程中培养液体体积不不变,不添加不添加营养成分养成分,待待细胞增胞增长和和产物物积累到适当的累到适当的时间,一次性收一次性收获细胞胞 产物物和培养液的培养方法和培养液的培养方法.11.液体培养液体培养 1 1成批培养法成批培养法 batch culturebatch culture特点：特点：操作操作简单，培养周期短，培养周期短.直接反映直接反映细胞生胞生长代代谢过程程.可直接放大可直接放大不能控制底物不能控制底物
8、浓度度 细胞易老化胞易老化 生生长周期周期短短 效率低效率低.两步两步成批培养法成批培养法即使用两个生物反即使用两个生物反应器，第一个反器，第一个反应器用器用于于细胞生物量的累胞生物量的累积，第二个反，第二个反应器用于次器用于次级代代谢产物的生物的生产。12.2.2.半半连续培养法培养法 semi-continuous culturesemi-continuous culture重复分批式培养或重复分批式培养或换液培养液培养.在在细胞增胞增长和和产物形成物形成过程中程中,每每间隔一段隔一段时间从中取出部分培从中取出部分培养液或养液或细胞胞,剩余的剩余的细胞作胞作为种子种子,再用新的培再用新的培
9、养液养液补足到原体足到原体积,使生物反使生物反应器内的器内的总体体积不不变.特点特点:细胞可持胞可持续指数生指数生长,并可保持并可保持产物和物和细胞在胞在一一较高的高的浓度水平度水平,培养培养过程中可延程中可延续很很长时间.可可进行多次收行多次收获.操作操作简便便,生生产效率高效率高.13.3 3连续培养法培养法(continuous culture)(continuous culture)连续培培养养法法是是利利用用连续培培养养反反应器器，在在投投料料和和接接种种培培养养一一段段时间后后，以以一一定定速速度度连续采采集集细胞胞和和培培养养液液，并并以以同同样速速度度供供给新新鲜培培养养基基以
10、以使使细胞胞生生长环境境长期期维持恒定的方法。持恒定的方法。该法法的的理理论基基础是是根根据据MonodMonod公公式式，即即生生长速速度度取取决于基决于基质的的浓度。度。maxmaxS/(Ks+S)S/(Ks+S)=特定生特定生长速度；速度；maxmax=特定最大生特定最大生长速度；速度；Ks=Ks=饱和系数；和系数；S=S=基基质浓度度两两阶段段连续培养法培养法于第一反于第一反应器中投入生器中投入生长培养基并培养基并连续加入加入该培养基，而于第二反培养基，而于第二反应器中投入生器中投入生产培养基。培养基。14.3 3连续培养法培养法(continuous culture)(continu
11、ous culture)特点特点:细胞胞能能在在近近似似恒恒定定状状态下下生生长、营养养物物质浓度度、产物物浓度度、pHpH基基本本保保持持恒恒定定，细胞胞浓度度以以及及细胞胞比比生生长速速率率可可基基本本维持持不不变，细胞胞维持持持持续指指数数增增长。稳定定状状态可可有有效效地地延延长分分批批培培养养中中的的对数生数生长期。期。15.3 3连续培养法培养法(continuous culture)(continuous culture)问题:一直有一直有细胞收胞收获，浓度一般不高度一般不高细胞分裂快、易胞分裂快、易变异；异；由由于于是是开开放放式式操操作作，加加上上培培养养周周期期较长，容易造
12、成，容易造成污染染对设备、仪器的控制技器的控制技术要求要求较高。高。16.悬浮培养浮培养（Suspension culture）悬浮培养是浮培养是细胞培养的基本方法，是将胞培养的基本方法，是将单个个游离游离细胞或小胞或小细胞胞团在液体培养基中在液体培养基中进行培行培养增殖的技养增殖的技术。特点特点 1.培养培养细胞可不断增殖，且生胞可不断增殖，且生长速度快。速度快。2.液体状液体状态下便于下便于细胞和胞和营养物养物质的充分接的充分接触和交触和交换，细胞状胞状态可以相可以相对保持一致。保持一致。17.细胞胞悬浮培养的建立浮培养的建立愈愈伤组织的的诱导悬浮系的建立与浮系的建立与继代培养代培养悬浮浮
13、细胞的生胞的生长动态悬浮浮细胞同步化胞同步化18.愈愈伤组织的的诱导选择适宜的外植体：幼胚、下胚适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。、子叶。选择适宜的培养基：适宜的培养基：较高激素高激素浓度；必要的度；必要的附加物附加物质。19.要求：松散性好、增殖快、再生能力要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外。其外观一般是色一般是色泽呈呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈的乳白或淡黄色，呈细小小颗粒粒状，疏松易碎状，疏松易碎20.悬浮系的建立与培养浮系的建立与培养callus150250ml flaskcentrifuge isolationsubculture1g/10ml medium100120 rmp cu
14、lture transfer 1 time/3d80 rpm21.22.成功的悬浮细胞培养体系特征悬浮培养分散性良好，浮培养分散性良好，细胞胞团较小，一般小，一般在在3050个个细胞以下。胞以下。均一性好，均一性好，细胞形状和胞形状和细胞胞团大小大致相大小大致相同。同。悬浮系外浮系外观为大小均一的小大小均一的小颗粒，培粒，培养基清澈透亮，养基清澈透亮，细胞色胞色泽呈呈鲜艳的乳白或的乳白或淡黄色。淡黄色。细胞生胞生长迅速，迅速，悬浮浮细胞的生胞的生长量一般量一般23天便可增加一倍。天便可增加一倍。23.24.25.悬浮细胞的生长动态26.悬浮细胞生长的衡量根据不同培养根据不同培养时间的的细胞数胞
15、数变化，或化，或细胞胞质量量变化。化。生生长速率速率(p)：不同：不同时间细胞密度胞密度(x)的自然的自然对数与起始密度数与起始密度(x0)的自然的自然对数之差与培养数之差与培养时间(t)的比的比值p(lnx-lnx0)/t鲜重：真空减重：真空减压过滤后称重，反后称重，反应细胞生胞生长情况情况干重：干重：鲜细胞烘干至衡重，反胞烘干至衡重，反应细胞胞质量量27.影响悬浮细胞生长的因素起始愈起始愈伤组织的的质量量接种接种细胞密度：胞密度：悬浮浮细胞的起始密度一般胞的起始密度一般在在0.52.5105个个细胞胞/毫升。接种初期的毫升。接种初期的细胞密度胞密度过低往往使延低往往使延迟期加期加长。最低有
16、效。最低有效密度：即能使密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种胞分裂、增殖的最低接种量。量。培养条件：培养基、方式、温度、培养条件：培养基、方式、温度、继代周代周期。期。28.影响悬浮细胞生长的因素培养基培养基应用用条件培养基条件培养基（生（生长过愈愈伤组织或或悬浮浮细胞的液体培养基）提供胞的液体培养基）提供单细胞生胞生长和分裂所需的特殊代和分裂所需的特殊代谢物。物。基本培养基成分的基本培养基成分的调节视不同的培养目不同的培养目的而定的而定 培养基培养基设计时,一般均以一般均以诱导愈愈伤组织形成的培养基形成的培养基为基基础进行行调整。常整。常用的培养基有用的培养基有MS、B5、LS、N6等。等。
17、植物激素和其他附加成分的植物激素和其他附加成分的应用。用。29.影响悬浮细胞生长的因素培养方式：培养方式：摇瓶，反瓶，反应器（气器（气动式、式、搅拌拌式）；分批培养，半式）；分批培养，半连续培养和培养和连续培养培养温度温度 25继代周期代周期指具有一定起始密度的指具有一定起始密度的细胞胞,从开始培养到从开始培养到细胞数目和胞数目和总重量增重量增长停止的一个停止的一个过程。程。培养周期的培养周期的长短是由起始短是由起始细胞密度、延胞密度、延迟期的期的长短、生短、生长速率等决定。速率等决定。继代培养（代培养（SubcultureSubculture）：继初代培养之初代培养之后的后的连续数代的数代的
18、扩繁殖培养繁殖培养过程。程。30.悬浮培养细胞的同步化细胞同步化：同一胞同步化：同一悬浮培养体系的所有浮培养体系的所有细胞都同胞都同时通通过细胞周期的某一特定胞周期的某一特定时期。期。植物植物细胞在胞在悬浮培养中容易浮培养中容易团聚并聚并进入不入不同程度的分化状同程度的分化状态，因此，要达到完全同，因此，要达到完全同步化是十分困步化是十分困难的。的。同一培养体系的植物同一培养体系的植物细胞胞经常不能常不能处于同于同一一细胞周期，胞周期，这种差异使种差异使悬浮浮细胞分裂、胞分裂、代代谢以及生理生化状以及生理生化状态等复等复杂化。化。通通过一定的理化措施可以使同一体系中的一定的理化措施可以使同一体
19、系中的细胞达到相胞达到相对同步化。同步化。什么措施？什么措施？31.细胞胞周周期期 32.饥饿法饥饿导致的致的细胞分裂受阻常常是使胞分裂受阻常常是使细胞不胞不能合成能合成DNA，即不能，即不能进入入S期，或期，或细胞分裂胞分裂不能不能进行，即不能行，即不能进入入M期。因此，通期。因此，通过饥饿法可以法可以获得得处于于G1和和G2期的同步化期的同步化细胞。胞。氮氮饥饿时，通常，通常获得得G1期的同步化期的同步化细胞胞磷和碳磷和碳饥饿时，获得得G1和和G2期的同步化期的同步化细胞。胞。将将饥饿细胞胞转入完整培养基中入完整培养基中继代培养代培养时，细胞分裂又可重新恢复。胞分裂又可重新恢复。33.抑制
20、剂法通通过一些一些DNA合成抑制合成抑制剂处理理细胞，使胞，使细胞滞胞滞留在留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可合成前期，当解除抑制后，即可获得得处于同一于同一细胞周期胞周期(G1)的同步化的同步化细胞。胞。常用抑制常用抑制剂主要有主要有5-氟脱氧尿苷氟脱氧尿苷(FudR)和和羟基基尿尿(HU)。用用羟基尿基尿处理理获得同步化得同步化细胞的方法在小麦、胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功胞培养中已有成功应用。用。利用破坏微管的利用破坏微管的药物将物将细胞阻断在中期，常用胞阻断在中期，常用的的药物有秋水仙素和秋水仙物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性胺，后者毒性较小
21、。小。34.分选法依据：依据：细胞体胞体积大小大小方法方法常常规分分选方法是梯度离心方法是梯度离心精精细的分的分选可采用流式可采用流式细胞胞仪优点点操作操作简单分分选细胞胞维持了自然生持了自然生长状状态，不会有其它，不会有其它处理理带来的副作用来的副作用缺点缺点分分选精精细度度较差差35.低温处理可以提高培养体系中可以提高培养体系中细胞同步化的程度胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡等曾采用此方法使胡萝卜卜悬浮浮细胞胞较好地同步化。好地同步化。梅梅兴国等（国等（2001）采用）采用6低温低温处理理红豆豆杉杉细胞也胞也获得得较明明显同步化效果。同步化效果。可能的原因可能的原因不同的温度
22、不同的温度对细胞的有胞的有丝分裂有极明分裂有极明显的的影响，在一定范影响，在一定范围内，温度下降使内，温度下降使细胞分胞分裂速度减慢，裂速度减慢，细胞周期延胞周期延长，从而相，从而相应地地延延长了分裂期的了分裂期的时间，使分裂指数提高，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。胞同步化率升高。36.单细胞培养意意义分离方法分离方法机械法机械法酶解法解法培养方法培养方法平板培养平板培养看看护培养培养微室培养微室培养双双层滤纸培养培养37.单细胞分离方法胞分离方法机械法机械法具体做法：具体做法：将叶片将叶片轻轻研碎、研碎、过滤离心、收集离心、收集净化化从未分化的疏松易碎的愈从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通
23、，通过摇床振床振荡获得分散的得分散的单细胞或小胞或小细胞胞团优点：点：细胞不受胞不受酶伤害；害；有利于有利于进行行细胞的生理和生化研究。胞的生理和生化研究。38.单细胞分离方法胞分离方法酶解法解法酶对细胞壁有一定的胞壁有一定的软化作用，所以采化作用，所以采用用酶法法时，必，必须加入甘露醇等渗透加入甘露醇等渗透压保保护剂；可通；可通过加入硫酸葡聚糖加入硫酸葡聚糖钾来提高来提高游离游离细胞的胞的产量。量。酶解法的解法的优点点可可获得得较多的叶肉游离多的叶肉游离细胞（但胞（但对禾本禾本科植物叶片效果不好）。科植物叶片效果不好）。39.细胞平板培养（胞平板培养（plating culture)指将一定
24、密度的指将一定密度的悬浮浮细胞接种到一薄胞接种到一薄层固体培固体培养基中养基中进行培养的技行培养的技术。Bergman(1960)首首创单细胞的分离：一般采用胞的分离：一般采用酶分离法，小分离法，小细胞胞团不能超不能超过6个个细胞。胞。单细胞胞悬浮液的制浮液的制备：分离的：分离的单细胞胞经培养培养基洗基洗涤2次以后，次以后，调整密度整密度为5103个个/毫升毫升植板：将植板：将1份已份已调整好密度的整好密度的单细胞胞悬浮液浮液与与4份份35的固体培养基充分混合均匀，然的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平后均匀地平铺于培养皿中，其厚度于培养皿中，其厚度为5mm左右。左右。40.细胞平板培养（胞
25、平板培养（plating culture)平板培养的效果一般用植板率来衡量。植平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能板率是能长出出细胞胞团的的单细胞在接种胞在接种单细胞胞总和中所占的比例。和中所占的比例。每个平板形成的每个平板形成的细胞胞团数数植板率植板率 每个平板接种的每个平板接种的细胞胞总数数41.细胞平板培养（胞平板培养（plating culture)优点：点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在胞在培养基中分布均匀，便于在显微微镜下下对细胞胞进行定点行定点观察，是察，是单细胞株胞株筛选和突和突变体体筛选的常用方法。的常用方法。由于它具有由于它具有筛选效率高、效率高、筛选量大、操量大
26、、操作作简便等便等优点，被广泛点，被广泛应用于用于细胞分裂、胞分裂、分化、生理生化、分化、生理生化、遗传变异、次生代异、次生代谢产物合成等。物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物缺点：通气状况不好，排泄物质易易积累造累造成毒害或影响成毒害或影响组织吸收。吸收。42.细胞胞悬浮浮过滤与培养基与培养基混合混合植板植板培养培养克隆愈克隆愈伤组织43.看护培养（nurse culture）Muir(1953)首首创此法此法获得烟草得烟草单细胞体系。胞体系。优点：点：简便易行，效果好。便易行，效果好。缺点：不能在缺点：不能在显微微镜下追踪下追踪细胞分裂、生胞分裂、生长过程。程。44.45.微室培养微室培养
27、(microchamber culture)在人工制造的无菌小室中，将一滴在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成形成细胞胞团的方法。由的方法。由Jones等在等在1960年年设计的。的。优点：可点：可对培养培养细胞胞连续进行行显微微观察，察，了解一个了解一个细胞的生胞的生长、分裂、分化等、分裂、分化等过程程缺点：培养基少，缺点：培养基少，营养和水分养和水分难以保持，以保持，pH变动幅度大，培养幅度大，培养细胞胞仅能短期分裂。能短期分裂。细胞起始密度：胞起始密度：3080个个/室。室。46.47.双层滤纸植板培养Hors
28、ch等等（1980）建建立立培养皿培养皿培养基培养基饲养养细胞胞层培养培养细胞胞 看看护滤纸转移移滤纸48.固定化培养法固定化培养法 将将细胞限制或定位于特定空胞限制或定位于特定空间位置的培养位置的培养技技术称称为细胞固定化培养。胞固定化培养。固定化培养采用的固定化反固定化培养采用的固定化反应器有网状多器有网状多孔板、尼孔板、尼龙网套和中空网套和中空纤维膜等多种膜等多种类型，型，将将细胞固定于尼胞固定于尼龙网套内，或固定于中空网套内，或固定于中空纤维反反应器的膜表面，或固定于网状多孔器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中板上，放入培养液中进行培养，或行培养，或连续流流入新入新鲜培养液，
29、培养液，进行行连续培养及培养及连续收集收集培养培养产物，也可通入物，也可通入净化空气以代替化空气以代替搅拌。拌。49.与与悬浮培养相比，固定化培养的浮培养相比，固定化培养的优点：点：提高了提高了药物的合成、物的合成、积累累；能能长时间保持保持细胞活力；胞活力；可以反复使用；可以反复使用；抗剪切能力抗剪切能力强；耐受有毒前体物耐受有毒前体物质的的浓度高；度高；遗传性状性状较稳定；定；后后处理理难度小。度小。50.固固定定化化植植物物细胞胞培培养养技技术要要进入入工工业化化生生产有有许多多问题尚待解决。尚待解决。首首先先，固固定定化化培培养养要要求求代代谢产物物必必须是是分泌到分泌到细胞外的。胞外
30、的。第第二二，植植物物细胞胞药物物的的积累累是是不不连续的的，这也限制了固定化也限制了固定化细胞方法的胞方法的应用。用。第三，易第三，易污染。染。Flash51.植物植物细胞胞规模化培养模化培养规模化培养体系的建立模化培养体系的建立生生 物物 反反 应 器器规模化培养的技模化培养的技术问题52.植物植物细胞大胞大规模培养的技模培养的技术要求要求从工程的角度从工程的角度讲必必须要要进一步研究和开一步研究和开发适宜适宜于植物生于植物生长和生和生产的生物反的生物反应器，建立最佳的器，建立最佳的控制和控制和调节系系统；从培养技从培养技术方面方面讲必必须满足以下三个条件：足以下三个条件：培养的培养的细胞
31、在胞在遗传上上应是是稳定的，以得到定的，以得到产量恒定的量恒定的产物。物。细胞生胞生长速度快，短速度快，短时间内能生内能生产较多多产物物产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中53.植物植物细胞胞规模化培养体系的建立模化培养体系的建立种子种子细胞胞选择种子种子细胞增殖与放大培养胞增殖与放大培养大大规模培养体系建立模培养体系建立54.种子种子细胞胞选择外植体外植体选择植物植物类型：型：遗传基基础。在确定生。在确定生产某一某一种化合物以后，首先必种化合物以后，首先必须准确准确选择那些那些能能够产生目的化合物的植物种生目的化合物的植物种类及品种及品种或或单株。株。组
32、织器官：由于天然器官：由于天然产物一般物一般为次生代次生代谢产物，而植物次生代物，而植物次生代谢产物的物的积累具累具有有组织器官的特异性，因此，在起始器官的特异性，因此，在起始细胞培养胞培养时尽量尽量选择自然状自然状态下下产生天然生天然产物的器官、物的器官、组织作作为外植体。外植体。55.种子种子细胞胞选择高高产细胞系的胞系的筛选悬浮浮细胞系胞系单细胞克隆胞克隆种种细胞增殖胞增殖56.种子种子细胞增殖与放大培养胞增殖与放大培养目的目的准准备材料材料提供技提供技术参数参数过程程摇瓶瓶反反应器器57.大大规模培养体系的建立模培养体系的建立培养方式培养方式成批培养、成批培养、连续培养和半培养和半连续
33、培养。培养。培养方式的培养方式的选择根据次生根据次生产物物积累而定，通常累而定，通常还根据不根据不同要求同要求进行改行改进。如当。如当细胞生胞生长和和产物物合成需要不同的培养基合成需要不同的培养基时，就需要采用，就需要采用两步法培养，先在两步法培养，先在细胞生胞生长培养基中培培养基中培养大批量养大批量细胞，当胞，当细胞生胞生长至合成至合成产物物的的阶段后，将其段后，将其转至至产物合成培养基中物合成培养基中培养，在培养，在产物合成物合成阶段又可采用段又可采用连续培培养方式以延养方式以延长细胞生胞生产时间。58.生物反生物反应器器类型及特点型及特点是指用于高等生物是指用于高等生物细胞批量化培养的装
34、置及胞批量化培养的装置及其相其相应控制系控制系统。适合植物适合植物细胞培养的反胞培养的反应器器应该具有适宜的具有适宜的氧氧传递、良好的流、良好的流动性和性和较低的剪切力。低的剪切力。搅拌式拌式气气动式式固定化式固定化式其它其它光照生物反光照生物反应器，器，转鼓式鼓式59.反反应器器类型型 体体积（L）培养植物种培养植物种类搅拌式拌式7，15D.carota 胡胡萝卜卜搅拌式拌式20，15500N.tabacum 烟草烟草搅拌式拌式5000C.roseus 长春花春花螺旋螺旋搅拌式拌式 20C.blumei 五彩五彩苏提升提升搅拌式拌式 2.5P.elliotii 湿地松湿地松鼓泡式鼓泡式20，
35、30，130P.ginseng 人参人参鼓泡式鼓泡式65，1500N.tabacum 烟草烟草外外环气升式气升式 10，30，85C.roseus 长春花春花导筒气升式筒气升式 20，210D.lanata 狭叶毛地黄狭叶毛地黄转鼓式鼓式14V.rosea 长春花春花植物植物细胞培养生物反胞培养生物反应器器60.搅拌式反拌式反应器器是根据植物是根据植物细胞特性在微生物胞特性在微生物发酵罐基酵罐基础上改上改进而成。而成。搅拌装置要减少剪切，一般改叶拌装置要减少剪切，一般改叶轮式式为螺旋式。螺旋式。必必须设计加液装置加液装置必必须设计通气装置通气装置适宜的取适宜的取样口口61.62.气气动式反式反
36、应器器又称空气提升式反又称空气提升式反应器器特点：剪切力小，但特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。拌不很均匀。Flash63.固定化反固定化反应器器特点：特点：较容易地控制培养系容易地控制培养系统的理化的理化环境，可以研境，可以研究特定的代究特定的代谢途径，便于途径，便于调节。细胞位置的固定使其所胞位置的固定使其所处环境境类似于在植物似于在植物体中所体中所处的状的状态，相互，相互间接触密切，可形成接触密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生一定的理化梯度，有利于次生产物合成。物合成。可以从培养基中提取可以从培养基中提取产物，免除了培养基中物，免除了培养基中因初因初级代代谢产物物积累造成累造成对代代谢
37、的反的反馈抑制，抑制，延延长生生产周期，周期，进行行连续生生产。64.固定化反固定化反应器器种种类：主要有流化床、膜反主要有流化床、膜反应器和填充反器和填充反应器器植物植物细胞固定化一般采取凝胶包埋、膜固定、胞固定化一般采取凝胶包埋、膜固定、网格和泡沫固定和表面吸附等。网格和泡沫固定和表面吸附等。包埋式固定化培养系包埋式固定化培养系统：支持物多采用：支持物多采用琼脂、脂、琼脂糖、藻酸脂糖、藻酸盐和聚丙和聚丙烯酰胺等胺等附着式固定化培养系附着式固定化培养系统：支持物多采用尼：支持物多采用尼龙网、聚氨网、聚氨酯泡沫和中空泡沫和中空纤维等。等。65.Alfermann等等(1983)用气升式系用气升
38、式系统，采用海，采用海藻藻钙固定固定细胞成功地用胞成功地用30 L和和200 L的反的反应器生器生产地高辛。地高辛。Jose等等(1983)进一步用中空一步用中空纤维反反应器培器培养胡养胡萝卜和碧卜和碧东茄生茄生产代代谢产物酚物酚类物物质Mavituna等等（1987）使用板式反使用板式反应器和循器和循环床反床反应器培养固定化辣椒器培养固定化辣椒细胞，最大辣胞，最大辣椒素生椒素生产速率（以干辣椒速率（以干辣椒细胞胞计）达到）达到0.5mg0.5mgg gd d，与成熟期辣椒合成辣椒素的，与成熟期辣椒合成辣椒素的速率相当。速率相当。66.规模化培养中有关工程技术问题悬浮培养系浮培养系统必必须适适
39、应植物植物细胞特性胞特性细胞体胞体积大。其平均直径比大。其平均直径比细菌大几十倍菌大几十倍通常以通常以2200个个细胞，直径胞，直径2mm大小的非大小的非均匀小均匀小细胞胞团形式存在。形式存在。抗剪切能力弱。抗剪切能力弱。生生长速度慢，周期速度慢，周期长，培养基成分复，培养基成分复杂，有，有利于微生物生利于微生物生长，因此在培养中，因此在培养中维持无菌持无菌环境境难度度较大但又十分重要。大但又十分重要。67.规模化培养中有关工程技术问题培养液的流培养液的流变特性粘度特性粘度变化化是由是由细胞密度和胞密度和细胞状胞状态变化造成的化造成的u烟草烟草细胞培养，当胞培养，当细胞密度低于胞密度低于7g/
40、L时，培养液粘度基本不，培养液粘度基本不变，而高于此，而高于此值时，培养液粘度增加。，培养液粘度增加。u长春花春花细胞培养密度在胞培养密度在10g/L时，培，培养液粘度有养液粘度有赖于于细胞年胞年龄、形、形态和和细胞胞团大小。大小。在相同物在相同物质浓度下度下,大大细胞胞团的的营养液表养液表观粘度明粘度明显大于小大于小细胞胞团的表的表观粘度。粘度。68.规模化培养中有关工程技术问题氧气含量氧气含量调节KLa（氧的（氧的传递系数，系数，Nv=Kla(C*-C)）：）：如在如在4L的气升式反的气升式反应器中器中进行行长春花春花细胞培养胞培养时，KLa在在20h-1左右左右时。细胞生胞生长与次生与次
41、生产物合物合成成维持在良好状持在良好状态；在在15L通通风式反式反应器中培养的烟草器中培养的烟草细胞，当胞，当KLa在在510h-1的范的范围内，生物量和代内，生物量和代谢产物随物随KLa增加而增加。增加而增加。溶氧溶氧浓度：毛地黄度：毛地黄细胞培养，当培养基氧胞培养，当培养基氧浓度度从从10饱和度上升至和度上升至30，细胞生胞生长速率从速率从0.15d-1上升至上升至0.20d-1，如果，如果继续上升至上升至 40，细胞生胞生长速率反而下降至速率反而下降至0.17d-1。69.规模化培养中有关工程技术问题CO2调节在通气在通气过程中，混入程中，混入24的的CO2能消除能消除高通气速率高通气速
42、率对长春花春花细胞生胞生长和次生代和次生代谢产物合成的不利影响。物合成的不利影响。70.规模化培养中有关工程技术问题泡沫和表面黏附性泡沫和表面黏附性植物植物细胞培养中易胞培养中易产生泡沫，且覆盖蛋白生泡沫，且覆盖蛋白质和粘多糖，和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循胞极易被包埋在其中从循环的培养液中的培养液中带出来，形成非均相培养而出来，形成非均相培养而影响培养系影响培养系统的的稳定性和生定性和生产率。率。消除方法消除方法化学消泡：天然油脂、高化学消泡：天然油脂、高级醇醇类、聚、聚醚类机械消泡机械消泡71.提高植物细胞药物产量的途径选择适宜的起始材料种适宜的起始材料种类、部位、部位栀子（子（Gar
43、denia jasminoidesGardenia jasminoides）胚）胚轴 银杏杏 子叶子叶 当当归 根根 红豆杉豆杉 幼嫩的茎幼嫩的茎茜草茜草 叶柄叶柄 72.高产细胞株的筛选直接直接筛选法法 红豆杉豆杉 紫杉醇紫杉醇玫瑰茄玫瑰茄 花色苷（比花色苷（比对照提高照提高14.514.5倍）倍）诱变育种法育种法伊伊贝母紫外光母紫外光黄黄连 6060Co Co（小檗碱含量达（小檗碱含量达6.12%6.12%）红豆杉豆杉 苯丙氨酸苯丙氨酸73.高产细胞株选择梅梅兴国（国（2001）通）通过在培养基中添加在培养基中添加1.6mM的的L-Phe，筛选出了抗出了抗Phe的的红豆杉豆杉细胞胞悬浮系，
44、其紫杉醇含量高于原型浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞胞35倍。倍。74.产生等于或高于生等于或高于亲本植物本植物药物含量的植物物含量的植物细胞培养系胞培养系统 植物种植物种类培培养养类型型化合物化合物含量（）干重含量（）干重 化合物化合物植物植物人参人参愈愈伤 人参糖苷人参糖苷27274.14.1海巴戟海巴戟悬浮浮 蒽蒽醌18182.22.2洋紫洋紫苏悬浮浮 迷迭香酸迷迭香酸16163.03.0紫草紫草悬浮浮 紫草宁紫草宁14141-21-2唐松草唐松草 悬浮浮 小檗碱小檗碱 10 0.01 日本黄日本黄连悬浮浮 小檗碱小檗碱10102-42-4蓬子菜蓬子菜悬浮浮 蒽蒽醌5.45.41.21.2
45、猪殃殃猪殃殃悬浮浮 蒽蒽醌3.83.80.20.2烟草烟草愈愈伤 烟碱烟碱3.43.42.02.075.优化培养基选择合适培养基种合适培养基种类及植物生及植物生长调节剂桅子桅子 藏藏红花酸花酸心心脏病病B B5 5，MG-5MG-5利于利于细胞生胞生长M-9M-9利于黄色素合成利于黄色素合成 （钟青平等青平等19941994）高山高山红景天景天红景天苷景天苷抗疲抗疲劳、抗缺氧、抗缺氧NAA;BANAA;BA好于好于2,4-D;IAA;KT2,4-D;IAA;KT（韩爱明等明等19971997）胡胡萝卜黄卜黄酮GA3 GA3 抑制抑制（Hindere et al.1984Hindere et a
46、l.1984）桔叶桔叶鸡眼藤眼藤 蒽蒽醌1mg/L NAA1mg/L NAA促；促；1mg/L 2,4-D1mg/L 2,4-D抑抑 （LinusLinus等等19951995）烟草烟草 尼古丁尼古丁 IAAIAA促；促；2,4-D2,4-D抑抑（Furuya1987Furuya1987）76.不同植物激素不同植物激素对长春花春花细胞的胞的悬浮培养物中生物碱浮培养物中生物碱产量的影响量的影响培养基培养基最大生物碱最大生物碱产量量(%干重干重)其它生物其它生物碱数量碱数量(化合物数量化合物数量)生生长培养培养生生产培养培养蛇根碱蛇根碱啊啊吗碱碱B B5 5+24D+KT+24D+KT B B5
47、5+24D+KT+24D+KT0.000.000.000.000 0B B5 5+24D+KT+24D+KT B B5 5-无激素无激素0.080.080.060.061 1B B5 5+24D+KT24D+KTB B5 5+IAA+KT+IAA+KT0.330.330.080.081010B B5 5+24D+KT+24D+KT MS+IAA+KTMS+IAA+KT0.040.040.020.022 2B B5 5+24D+KT+24D+KT MS+IAA+BAMS+IAA+BA0.30.30.450.452 2M3-CMM3-CMM3-CMM3-CM0.580.580.140.141414
48、B B5 5+NAA+KT+NAA+KT B B5 5+NAA+KT+NAA+KT0.240.240.060.061212M3-CMM3-CMMS+IAA+BAMS+IAA+BA1.001.000.040.049 9B B5 5+NAA+KT+NAA+KT MS+IAA+BAMS+IAA+BA0.420.420.320.325 577.优化培养基(调节碳源)增加碳源可促增加碳源可促进次生代次生代谢物物质的的积累累 彩叶草彩叶草细胞胞 迷迭香叶宁酸迷迭香叶宁酸 化化妆品品长春花春花细胞胞 阿阿马里新、利血平里新、利血平高血高血压红豆杉豆杉细胞胞 紫杉醇紫杉醇 葡萄葡萄细胞胞 花青素花青素血管的守
49、血管的守护神神78.优化培养基(添加有机物)在在红花花（Carthamus Carthamus linctoriuslinctorius）培培养养细胞胞中中加加入入0.10.1水水解解酪酪蛋蛋白白，可可使使维生生素素E E的的产量提高量提高约5 5倍（倍（Yamamoto et alYamamoto et al，19891989）。）。1010%椰椰乳乳，能能明明显促促进滇滇紫紫草草愈愈伤组织紫紫草草素素的的产生生，其其紫紫草草素素的的含含量量是是对照照的的2424倍倍(周周立立刚等等1991)1991)。紫草素肝胆疾病紫草素肝胆疾病辅助用助用药甘甘烦远等（等（19971997）研究表明，云南
50、）研究表明，云南红豆杉豆杉悬浮浮细胞适宜的培养基胞适宜的培养基为B B5 5，当添加椰子汁，当添加椰子汁(CM)CM)、酪蛋白氨基酸、酪蛋白氨基酸(CA)(CA)和水解乳蛋白和水解乳蛋白(LH)3(LH)3种有机物种有机物时，均能提高培养，均能提高培养细胞中紫杉胞中紫杉醇的含量，而且醇的含量，而且CMCM和和CACA还能促能促进细胞的生胞的生长。79.调节pHpH值及光照及光照 控制控制pHpH培养基将有利于培养基将有利于药物的生成。物的生成。南方南方红豆杉愈豆杉愈伤 pH 5.5 pH 5.5 对愈愈伤组织生生长最最为有利有利pH 7.0 pH 7.0 对紫杉醇紫杉醇积累最累最为有利有利大槭