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1、THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES实验二实验二 ELISA法检测乙型肝炎病毒法检测乙型肝炎病毒表面抗原表面抗原授课教员：田易授课教员：田易 讲师讲师授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES教学重点教学重点 酶联免疫反应的原理实验目的实验目的了解：1、酶联免疫吸附实验的主要类型和应用 2、酶促底物反应的原理及检测方法理解：酶联免疫
2、吸附实验的操作步骤及标准曲线的绘制教学难点教学难点 标准曲线的绘制THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES 使使用用教材教材免疫学实验第一版 朱道银 吴玉章 科学出版社 2008 参参 考考 书书免疫学第四版 龚非力 科学出版社 2007 Medical Immunologyedical Immunology10th10th，T.G.ParslowT.G.Parslow 推荐网站推荐网站医学免疫学网络教学 http:/192.168.10.21/mta/美国国立生物技术信息中心：http:/www.nc
3、bi.nlm.nih.gov中国生物信息网：http:/www.biosino.orgTHIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES怎样检测体液中微量的抗原抗体？怎样检测体液中微量的抗原抗体？灵敏性灵敏性1)1)肿瘤方面：包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白、癌胚蛋白等。肿瘤方面：包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白、癌胚蛋白等。2)2)内分泌方面：激素类包括雌激素、黄体素等。内分泌方面：激素类包括雌激素、黄体素等。3)3)传染病方面：病原体抗原如传染病方面：病原体抗原如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg等。等。
4、THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES 抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 特异性特异性 酶的高效催化作用酶的高效催化作用 灵敏性灵敏性 19711971年瑞典学者年瑞典学者 EngvallEngvall和和PerlmannPerlmann荷兰学者荷兰学者Van Weeman Van Weeman 和和SchuursSchuurs分别报道分别报道将免疫技术发展为将免疫技术发展为检测体液中微量物质的检测体液中微量物质的固相免疫测定方法固相免疫测定方法，称为，称为酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验enzyme
5、 linked immunosorbent assaysenzyme linked immunosorbent assays，ELISAELISATHIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES1实验原理实验原理2 实验方法实验方法 3实验结果实验结果4注意事项注意事项THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCESELISA实验原理实验原理THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF
6、BASIC MEDICAL SCIENCESELISA实验原理实验原理 样本样本固体表面固体表面结合结合洗涤洗涤加入酶标记二抗加入酶标记二抗加底物显色加底物显色 将已知抗原或抗体吸附在将已知抗原或抗体吸附在固相载体固相载体表面上，使表面上，使抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将固相上抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将固相上的抗原的抗原-抗体复合物与液相中的游离成分分离，通过抗体复合物与液相中的游离成分分离，通过酶标记抗体酶标记抗体分解底物发生呈色反应。分解底物发生呈色反应。THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL
7、SCIENCESELISAELISA实验原理实验原理 ELISA ELISA是一种基于是一种基于抗原抗体反应抗原抗体反应的免疫测定。的免疫测定。其基础是其基础是抗原或抗体的固相化抗原或抗体的固相化及及抗原或抗体的酶抗原或抗体的酶标记标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接产物的量与标本中受检物质的量直接相关相关，由此进行定性或定量分析。，由此进行定性或定量分析。THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCESELISA分
8、类分类p直接法直接法p双抗体夹心法（测抗原常用）双抗体夹心法（测抗原常用）p双抗原夹心法（测抗体常用）双抗原夹心法（测抗体常用）p间接法（测抗体常用）间接法（测抗体常用）p竞争抑制法竞争抑制法 THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES双抗体夹心法双抗体夹心法Y Y Y YY Y Y YY Y Y YYEYEYEYE将已知抗体吸附将已知抗体吸附在固相上在固相上加入待检样本，样加入待检样本，样本中的抗原与固相本中的抗原与固相上的已知抗体结合上的已知抗体结合加入酶标记抗体加入酶标记抗体酶催化底物显色酶催化底物
9、显色主要用于抗原含量测定主要用于抗原含量测定THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES间接法间接法YYYYYYYYYEYEYEYE将已知抗原包被将已知抗原包被在固相上在固相上样本中相应的特异性抗样本中相应的特异性抗体（一抗）与固相中的体（一抗）与固相中的抗原结合抗原结合加入酶标记二抗加入酶标记二抗酶催化底物显色酶催化底物显色主要用于抗体含量测定主要用于抗体含量测定THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES1实验原理实
10、验原理2 实验方法实验方法 3实验结果实验结果4注意事项注意事项THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES本次实验本次实验 采用双抗体夹心法检测乙采用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒型肝炎病毒表面抗原表面抗原THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES实验材料实验材料p乙乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒酶标记抗体酶标记抗体阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照显色剂显色剂A A 显色剂显色剂B B 终止
11、液终止液p样本样本pBIO-RAD Model 3500BIO-RAD Model 3500自动酶联检测仪自动酶联检测仪（TMB显色系统）显色系统）THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES包被抗体（采用抗体预包被板）包被抗体（采用抗体预包被板）加入样品，结合孵育加入样品，结合孵育30min（梯度稀释的阳性标准品和待检样本等）（梯度稀释的阳性标准品和待检样本等）洗涤洗涤每孔加入一滴酶标记抗体每孔加入一滴酶标记抗体孵育孵育30min洗涤洗涤每孔加显色剂每孔加显色剂A、B各一滴各一滴 避光孵育避光孵育15mi
12、n加入终止液终止反应加入终止液终止反应实验流程实验流程THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCESp包被抗体（已准备好）p本次实验体系为50ul 每组阳性样品1管，共100ul；首先取50ul到第1孔，剩余50ul的阳性样品管中加入100ul稀释液做3倍稀释，混匀，取50ul到第2孔；直到第5孔，37孵育30min p弃尽每孔液体，用洗涤液洗3次p每孔加入一滴酶结合物（酶标二抗），37孵育30minp弃尽每孔液体，用洗涤液洗3次p每孔加显色剂A、B各一滴，37避光孵育15minp加入一滴终止液终止反应实验步
13、骤实验步骤THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 阳性样品（阳性样品（3倍稀释）倍稀释）待测样品待测样品（复孔）（复孔）阴性对照阴性对照（复孔）（复孔）空白对照空白对照100lPBS100lPBS100lPBS100lPBS阳2345p3倍梯度稀释阳性样品倍梯度稀释阳性样品p加样孔序加样孔序THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES设立对照设立对照p空白对照空白
14、对照 仅用稀释液代替检测样本，确保实验体系中没有仅用稀释液代替检测样本，确保实验体系中没有非特异性分解底物的物质，避免假阳性非特异性分解底物的物质，避免假阳性p阳性对照阳性对照标准品作系列稀释，可以对应标准品作系列稀释，可以对应ODOD值求出标准曲线，值求出标准曲线，并避免假阴性并避免假阴性p阴性对照阴性对照 与待捡物具有同源性和同质性，又不含有待检物与待捡物具有同源性和同质性，又不含有待检物质的阴性样品（如待检样本为人的血清，阴性对质的阴性样品（如待检样本为人的血清，阴性对照便为不含待检物的标化人血清）照便为不含待检物的标化人血清）THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERS
15、ITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES1实验原理实验原理2 实验方法实验方法 3实验结果实验结果4注意事项注意事项THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES结果分析结果分析p肉眼观察肉眼观察：显色为阳性，无色为阴性。：显色为阳性，无色为阴性。p酶免分析仪检测酶免分析仪检测：450nm450nm波长，空白孔调零，测各波长，空白孔调零，测各孔吸光光度值孔吸光光度值ODOD450450。p结果判定：以待测样本结果判定：以待测样本ODOD值值/阴性对照阴性对照ODOD值值2.12
16、.1为为阳性，反之阴性。阳性，反之阴性。p如果阳性孔为阴性，考虑是否是酶标抗体或者显如果阳性孔为阴性，考虑是否是酶标抗体或者显色剂等失效色剂等失效THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES标准曲线的绘制方法THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES1实验原理实验原理2 实验方法实验方法 3实验结果实验结果4注意事项注意事项THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASI
17、C MEDICAL SCIENCESp加样加样 必需保证每个孔之间的样本量相同必需保证每个孔之间的样本量相同p孵育孵育 孵育时贴封片或加盖孵育时贴封片或加盖p洗板洗板 洗板要彻底，不同样品之间枪头必须替换洗板要彻底，不同样品之间枪头必须替换p显色显色 如果样本较多的话，速度要快，以保持各个如果样本较多的话，速度要快，以保持各个 样本孔间的均一性样本孔间的均一性p终止终止 应避免产生气泡应避免产生气泡 操作注意事项操作注意事项THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES思考题思考题pELISA相对与其他的免疫
18、检测技术有很高的灵相对与其他的免疫检测技术有很高的灵敏度，这是为什么？敏度，这是为什么？pELISA都有什么类型，分别适用与检测哪些物都有什么类型，分别适用与检测哪些物质？质？p如果在结果显示，阴性对照显色，有可能是哪如果在结果显示，阴性对照显色，有可能是哪些方面的问题？些方面的问题？THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES实验报告实验报告p实验名称实验名称p实验目的实验目的p实验原理实验原理p实验步骤实验步骤p结果分析结果分析p思考题思考题THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCESThank you！