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1、医疗器械产品无菌检验操作规程 1 目的 通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。2 适用范围 适用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检验。3 检验依据 本厂产品注册标准（编号）EN1174-1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估 中国药典（2005 年版）GB14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法 GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 4 仪器、设备 百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子天平、PH 计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管
2、架，大试管若干等。5 无菌检验室的环境要求 5.1 无菌检验应在环境洁净度10000 级下的局部百级的单向流空气区域内进行。5.2 缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检验室的室温应保持 1826，相对湿度：4565%。5.3 无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。5.4 无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的
3、左中右置 3 个营养琼脂平板，暴露 30min，于 3035培养 48 小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。6 无菌检验前的准备 6.1 器具灭菌、消毒 6.1.1 灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱 160以上干烤2 小时，或置压力蒸汽灭菌器内 121蒸汽灭菌 30 分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过 2 周即用毕，否则应重新灭菌。6.1.2 消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防
4、止产生耐药菌株。6.1.3 标识：器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。6.2 人员、物料进入无菌检验室 6.2.1 开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30min。6.2.2 物料进入无菌检验室流程 6.2.2.1 脱包：进入无菌检验室的物品若有双重包装的，需将外包装在传递窗/缓冲间拆除后，传入试验室。6.2.2.2 消毒：进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。6.2.2.3 传递：查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内。符合要求的经传递窗传入
5、无菌检验室。6.2.3 人员进入无菌检验室流程 6.2.3.1 更鞋脱衣：在一更区脱去一般区工作鞋，穿上无菌检验室工作鞋；脱去一般区工作服。6.2.3.2 洗手：首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗 20 秒，洗净泡沫。6.2.3.3 更衣：在二更区按照从上到下的顺序穿戴无菌工作服（包括衣、帽、口罩等），要求裤子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。6.2.3.4 手消毒：用消毒液浸泡双手 5 秒以上或用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用洗必泰、新洁尔灭、碘伏、75%酒精等。6.2.3.5 人员进入：经缓冲间进入无菌检验室。6.2.4 人员进入无菌检验室后，进一步用消毒
6、液擦拭工作台面，戴无菌手套。7 无菌检验操作要求 7.1 全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。7.2 使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。7.3 所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。7.4 使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。7.5 在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。7.6 操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121灭菌 30 分钟。8 培养基制备 8.1 需气菌、厌
7、气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备 8.1.1 所用试剂 酪胨（胰酶水解）15.0g 葡萄糖 5.0g L-胱氨酸 0.5g 硫乙醇酸钠 0.5g（或硫乙醇酸）（0.3ml）酵母浸出粉 5.0g 氯化钠 2.5g 新配制的 0.1%刃天青溶液 1.0ml 琼脂 0.75g 水 1000ml 8.1.2 制备 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 为 7.10.2。8.1.3 硫乙醇酸盐流体培养剂氧化层的颜色要求 在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/5，否刚需经 100水浴加热到粉
8、红色消失（不超过 20 分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。8.2 霉菌培养基（改良马丁培养基）的制备 8.2.1 所用试剂 胨 5.0g 酵母浸出粉 2.0g 葡萄糖 20.0g 磷酸二氢钾 1.0g 硫酸镁 0.5g 水 1000 ml 8.2.2 制备 除葡萄糖外，取上述成分混和，微温溶解，调节 pH 值约为 6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 为 6.40.2。8.3 还可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基，按照使用说明书配制。8.4 培养基配制后应尽快灭菌，避免微生物繁殖。一般采用高压蒸汽 121灭菌 30 分钟。8.5 制备好的培养基应在 225保存，
9、在 3 周内使用。8.6 培养基的无菌性检查 每批配制的培养基均应进行无菌性检查（可与产品无菌检验同步进行）。检查时，每批培养基随机取不少于 5 支（瓶）培养 14 天，应无菌生长。9 稀释液、冲洗液的制备 9.1 0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121灭菌 30 分钟后，于 4保存备用。,分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121灭菌 30 分钟后，于 4保存备用 9.2 pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾 3.56g、磷酸氢二钾 7.23g、氯化钠 4.30g、蛋白胨 1.0g，加水 1000ml。微温溶解，滤清
10、，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121灭菌 30 分钟后，于 4保存备用。9.3 浸提介质：9g/L 无菌氯化钠溶液，可直接从有证单位采购大输液。10 对照菌液制备 10.1 无菌检验所用的菌株传代次数不得超过 5 代。10.2取金黄色葡萄球的普通琼脂斜面培养物，接种一白金耳至营养琼脂培养基内，在3035培养1824h 后备用，同时制备 0.9%氯化钠溶液加入在 6 支小试管内，每支试管内加 9.0ml 的 0.9%氯化钠溶液，在压力锅内经 121灭菌 30min 备用。将已配好的金黄色葡萄球菌培养菌液取 1.0ml 加入第一支小试管内，稀释成浓度 1:10 的菌液；取第一支试管内 1.0m l
11、 菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度1:100 的菌液，同法稀释成浓度 1:106（每 ml 含菌量100CFU）即可。10.3 采用平皿计数法测定活菌数。11 无菌检验培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基，置 3035培养。改良马丁培养基，置 2328培养。12 无菌检验 12.1 如产品注册标准中明确“产品应经过一个确认过的灭菌过程”，则执行 12.1 项下各项。12.1.1 放样 每个灭菌批次按已验证的灭菌工艺，在灭菌柜内相应的位置放置适量菌片，灭菌后对菌片进行无菌检验。12.1.2 菌片贮存 灭菌前、后菌片应按菌片说明书规定条件保存。（REVEN 公司菌贮存温度为 1527）12.1.3 接
12、种 开启超净工作台单向层流，在此环境下，分别将灭菌后的菌片成对放入已灭菌的硫乙醇酸盐流体培养基中。同时以金黄色葡萄球菌作阳性对照，以未接种的硫乙醇酸盐流体培养基和未接种的改良马丁培养基作为阴性对照。12.1.4 培养 阳性对照管于 3035细菌培养箱培养 4872 小时。其余硫乙醇酸盐流体培养基于3035培养 7 天。改良马丁培养基于 2328培养 7 天。12.1.5 结果判定 培养后，阳性对照应有菌生长，阴性对照和被检样品未见需气菌、厌气菌和霉菌生长的为合格。12.2 如产品注册标准中明确产品应进行无菌检验，则执行 12.2.112.2.5。12.2.1 抽样 根据各自的产品注册标准和相应
13、产品出厂检验规程的规定，对成品库内的产品进行抽样。一般同一个灭菌批产品检验 311 个单位供试品。12.2.2 供试液准备 优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养的方法，如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面，供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后 2 小时内使用。根据供试品具体特性选择下列方法：a)管类器具：按管内表面积每 10cm2流过管内腔 1ml 浸提介质，流量约为 10ml/min，收集到无菌的容器内。b)容器类器具：按容器内表面积每 10cm2加入浸提介质 1ml 的比例，振摇数次。c)实体类器具：实体类器具按表面及
14、每 10cm2加入浸提介质 1ml，振摇数次。收集上述冲洗液或浸提介质于无菌容器中。12.2.3 接种 12.2.3.1 薄膜过滤法：优先采用封闭式薄膜过滤器（集菌器），也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于 0.45。滤器和滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌，或直接采用无菌集菌器。a、如采用封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培养管的量基本均匀。然后通过集菌仪一只加 120ml 改良马丁培养基，另两只分别加入 120ml 硫乙醇酸盐培养基（其中一只做阳性对照，内加金黄色葡萄球菌液 1ml）。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质 120ml通过集菌仪过
15、滤（每只约 50ml），同法一只加硫乙醇酸盐培养基 120ml，另一只加改良马丁培养基 120ml分别作阴性对照。b、如用一般薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成 3 等份，分别置于含 50ml 硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对照。12.2.3.2 直接接种法：适用于一次性使用注射针、一次性使用静脉输液针（包括输液器、输血器、注射器配套使用注射针）。a、敷料供试品：取规定数量，每个包装以无菌操作拆开，于不同部位剪取约120mg 或 1cm3cm 的供试品，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。b、无菌针头：直接投入含 15ml 以上硫乙醇酸盐
16、流体培养基及改良马丁培养基的容器中。c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎断，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作阳性对照。每个容器中培养基的用量应符合：接种的供试品体积不得大于培养基体积的 10%，或培养基的装量足以浸没供试品。每管培养基的最低用量硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于 10 ml.12.2.4 培养、观察 上述含培养基的容器分别置规定温度的恒温培养箱中，除阳性对照管培养 4872 小时外，其余管培养14 天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供
17、试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养 14 天后，不能从外观上判断有无微生物生产，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养 2 天，真菌培养3 天，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。12.2.5 结果判断 培养结束后，阳性对照管应有菌生长，阴性对管应澄清。否则，就判结果无效。所有供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。若供试品管中任何 1 管显浑浊并确证有菌生长判供试品不符合规定。以一次检出为准，不得复试。当符合下列至少一个条件时，可判试验结果无效；1）无菌检验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检验法的要求；2）回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；3）阴性对照管有菌生长；4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌检验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的；13 质量记录