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1、ctDNA 检测技术 循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA，ctDNA）来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的 DNA 片段，是循环游离 DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）的一部分1.ctDNA 含有与其来源肿瘤 DNA 同样的基因缺陷,如点突变，重排，扩增等2；其在血液中的半衰期短，可实时反映肿瘤的动态变化3;作为液体活检的一种,可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面4,因此ctDNA 的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、肿瘤的疗效评估、复发监测和预后判断等5。由 ctDNA 的质量和数量变化大,因此需要高特异性和高
2、灵敏度的检测方法。目前常用的方法有数字 PCR（digital PCR，dPCR）、BEAMing(bead，emulsion，amplification and magnetic)、高通量测序(next generation sequencing,NGS)、ARMS 等6。1.数字 PCR 1999 年 Vogelstein 等提出了数字 PCR(digtal PCR，dPCR）的概念7.数字 PCR包括两部分,即 PCR 扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小的反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子,然后分别对目标分子进行扩增,扩增结束后对每个反应单元的荧光信
3、号进行采集.数字 PCR 采用直接计数的方法进行定量分析,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，记为 1,无荧光信号的则即为0,理论上,在样品中极限稀释的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA 分子的拷贝数。但是有的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进行计算8.不同于传统的 qPCR 技术,数字 PCR 不受扩增曲线的循环阈值(CT)和扩增效率的影响，无需参照，准确性和重复性好，可实现绝对定量分析9。根据反应单元类型不同,数字 PCR 分为三类:微反应室/孔板数字 PCR、微流控芯片和微滴数字 PCR 系统。微反应室/孔板数字 PCR 借
4、助高通量自动上样设备和增加的反应单元数，实现快速精确取样，提高检测灵敏度。微流控芯片技术是一种基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片的 dPCR 平台，可实现高通量、低成本分析.微滴数字 PC(droplet digital PC,ddPCR)是将含有目标分子的样品分成成千上万个纳升级的油包水微滴,再对每个微滴进行扩增，和荧光信号的采集,更容易实现小体积和高通量10。数字 PCR 可绝对定量，是目前灵敏度最高的检测技术，但其也存在一定缺点，如生成的微滴必须服从泊松分布，所以不适合高浓度 DNA 样本检测,；只能检测已知的突变且一次只能检测一种突变11,12.2.BEAMing 技术 BEAMin
5、g 技术在检测 ctDNA 内体肿瘤突变具有非常高的灵敏度，它是结合了数字 PCR 以及流式技术的一种检测方法,最早是由 Bert Vogelstein 提出。其方法是每一类 DNA 分子都会专一的与磁性珠相连接，然后 DNA 分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠(Bead)、乳浊液（Emulsion）、扩增(Amplification)、磁性（Magnetic)，这四个主要组分来构建的,所以被称作为 BEAMing13。BEAMing 技术的过程包括：首先是分离和纯化血浆中的 DNA；接着是预扩增步骤,通过使用常规 PCR 扩增目的基因片段，使用引物与已
6、知的标记序列混合；然后，这些 DNA 模板再通过乳液 PCR 扩增，应用引物探测这些序列,通过链酶亲和素磁珠相互作用与有磁性的微胶珠结合.通过这种方式设计的系统，在反应结束之前，每个乳液液滴中生成的PCR 产物将保持对微胶珠的附着性,使其可以很容易地通过磁性进行分离和纯化14.并且，BEAMing 技术是利用磁珠来吸附游离 DNA,它可以从 1 万个健康细胞 DNA 中检测出那一个 ctDNA 分子，具有较高的敏感性,同时在很多研究中其在肿瘤组织中发现的突变都和 ctDNA 部分突变是一致的15，16。BEAMing 技术相比其他检测技术具有很多优势：(一）在常规实验室条件下，数以万计的 DN
7、A 分子可以通过该种方法来进行评估.（二)特异的突变可以通过流式细胞仪进行分离筛选以备进一步分析和研究。（三)BEAMing 技术可以用来对特定组织或者人群中罕见的突变，以及研究一般基因序列或转录的产物的变异都可以提供相应的鉴别和定量分析。由于外周血流中 ctDNA 拷贝的数量是很低的，特别是相较于野生型 DNA 来说。出于这个原因，使用 PCR 进行 DNA 扩增是 BEAMing 过程中的一个重要部分，是确保可靠检测的保证5。然而，BEAMing 这项检测技术只能检测已知突变,且成本较高17 同时，它的操作也较复杂,通量低,且单分子扩增在非均一的微滴中实现,需要 RCR 预扩增,会增加试验
8、误差12。3。基于 NGS 技术的检测方法 ctDNA 检测技术，除了基于 PCR 检测方法之外,还有一种以高通量测序技术，又称“下一代测序技术（NGS）为基础的检测方法。这种方法主要是选定十几到几十个肿瘤相关基因进行测序，测序通量和效率高.根据富集策略的不同，基于 NGS 的技术目前又可分为靶向扩增子测序(TAS）及目标序列捕获测序（TCS）。靶向扩增子测序(TAS）技术是针对目的基因设计几十对甚至上百对 PCR 引物，利用多重 PCR 扩增富集.代表性方法有标记扩增深度测序(TAMSeq）。Forshew等18 通过 TAMSeq 测序技术，检测患者癌细胞中ctDNA 片段，从而找到肿瘤样
9、品中的遗传突变。这种方法无需外科手术或者活检，就可以找到癌症突变。目标序列捕获测序(TCS）技术是针对目的基因设计探针，通过捕获杂交的方法富集,代表性方法有深度测序肿瘤个体化建档法（CAPPSeq）。Newman 等19从肿瘤基因突变数据库找复发突变相关的外显子，再从肿瘤基因图谱库的 407位非小细胞肺癌患者全基因组测序结果筛选。然后应用迭代算法使每个非小细胞肺癌患者样本的错义突变最大化来简化筛选器（selector）的大小，最后的 selector能识别 139 个复发突变基因中的 521 个外显子和 12 个内含子，长度约为 125kb,平均能够识别 4 个单核苷酸突变(SNV），在 96
10、%的肺腺癌或鳞癌患者身上有效。基于 NGS 技术的检测方法灵敏度高,能同时检测多个基因的多种变异。但是其技术复杂，数据处理困难，实验室水平差异较大，仪器与试剂的成本相对较高。想要临床应用，首先要将其标准化12。4.ARMS 技术 ARMS，全称为突变扩增系统（Amplification refractory mutation system），是由Newton 等人首先建立并用于检测基因已知突变的方法20。利用 PCR 引物 3端碱基必须与其模板 DNA 互补才能进行有效扩增的基本原理，根据已知突变位点设计引物，使 3末端碱基分别与突变和野生型模板碱基进行互补，实现扩增，达到将“突变模板与“野生
11、模板区分的目的12。ARMS 法的主要特点有高特异性，高灵敏度以及耗时短,成本低，操作简单等特点。其检测结果的高特异性关键在于引物设计。ARMS 法所用的引物是通过筛选能够识别单个位点等位基因的引物，进而保证了结果的高特异性。而 ARMS法检测点突变的检出率还取决于PCR反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配可能发生的错配延伸.PCR 反应条件的优化可以通过改变引物浓度、靶 DNA 浓度、Taq 酶浓度以及反应体系温度进行调整21.此外,在反应体系中加入甲酰胺可以减少非特异性扩增,在引物 3末端引入第二个错配碱基也可以提高引物的特异性21.通过在体系中加入多对引物可以实现多重扩增，实现基因的多
12、位点突变检测22。ARMS 法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，可检测出样品中含量低至 0。1%1。0%的突变基因；且该方法结合 PCR 技术，操作简单，耗时短，成本低，结果直观23。目前，ARMS 法已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。但该方法只能用于检测已知突变，在一定程度上限制其应用。ARMS 法检测可以分为实时荧光定量 PCR 和巢式 ARMS 法电泳检测。实时荧光定量 PCR 是指 ARMS 技术结合探针对扩增产物进行检测，在实时定量 PCR平台上实现对样品 DNA 中稀有突变的检测24.而巢式 ARMS 法电泳检测
13、是利用凝胶电泳技术检测扩增带，从而实现结果分析25.随着ARMS技术的发展，商品化的ARMS试剂盒相继问世,包括人表皮生长因子受体（EGFR）基因突变检测试剂盒,人KARS基因突变检测试剂盒，四项耳聋基因检测试剂盒等13。总结 作为重要的肿瘤分子标志物，ctDNA 在肿瘤的诊断、治疗监测、预后等方面发挥着重要的作用，而 DNA 测序技术的发展使得通过检测 ctDNA 来指导肿瘤的临床进展变得更加切实可行.数字 PCR 技术、BEAMing 技术、NGS 技术、ARMS技术在 ctDNA 的检测中各具其独特的优势和不足之处,实际应用时应结合具体条件决定采用何种检测方法.相信随着技术的进步，ctD
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