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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分别与计数分别与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能干脆尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能干脆被农作物吸取。土壤中的细菌将尿素分解成氨之被农作物吸取。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的缘由、细菌利用尿素的缘由土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O4 4、课题目的、课题目的从土壤中分别出能够分解尿素的细
2、菌从土壤中分别出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中原委含有多少这样统计每克土壤样品中原委含有多少这样 的细菌的细菌一一.探讨思路探讨思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置比照设置比照 1 1、实例：、实例：启示：找寻目的菌种时要依据它对生存环境的启示：找寻目的菌种时要依据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去找寻。要求，到相应的环境中去找寻。缘由：因为热泉温度缘由：因为热泉温度7070800C800C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应是多聚酶链式反应是一种在体外将少量一种在体外将少量DN
3、ADNA大量复制的技术，此项大量复制的技术，此项技术要求运用耐高温技术要求运用耐高温（930C930C）的）的DNADNA聚合聚合酶。酶。.筛选菌株筛选菌株2 2、试验室中微生物的筛选原理：、试验室中微生物的筛选原理：人为供应有利于目的菌株生长的条件人为供应有利于目的菌株生长的条件(包括包括养分、温度、养分、温度、pHpH等等)，同时抑制或阻挡其他微生，同时抑制或阻挡其他微生物生长。物生长。什么是选择性培育基？什么是选择性培育基？15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH
4、2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分别与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分别与计数所需培育基：育基：从物理性质看此培育基属于哪类？从物理性质看此培育基属于哪类？固体培育基固体培育基在此培育基中哪些作为碳源、氮源？在此培育基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培育基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微培育基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生
5、长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培育基就能够选择出分解尿素的微生物。此培育基就能够选择出分解尿素的微生物。5 5、培育基选择分解尿素的微生物的原理、培育基选择分解尿素的微生物的原理6 6、怎样证明此培育基具有选择性呢？、怎样证明此培育基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培育基的培育基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培育基培育基是是分别分别尿素尿素细菌细菌推断该推断该培育基培育基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是6 6、怎样证明此培
6、育基具有选择性呢？、怎样证明此培育基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培育基的培育基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培育基培育基是是分别分别尿素尿素细菌细菌推断该推断该培育基培育基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1 1、显微镜干脆计数：、显微镜干脆计数：利用血球计数板，在显微镜下计算确定容积里利用血球计数板，在显微镜下计算确定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不
7、适于对运动细菌的计数；须要相对高的细菌浓度；须要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以视察；个体小的细菌在显微镜下难以视察；缺点缺点2.2.间接计数法（活菌计数法）间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培育基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖育基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度
8、下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。留意事项留意事项为了保证结果精确，一般选择菌落为了保证结果精确，一般选择菌落数在数在3030030300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培育计算出菌落平均数。涂布，培育计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低。低。设置比照的主要目的是解除试验组中非测试设置比照的主要目
9、的是解除试验组中非测试因素对试验结果的影响，提高试验结果的可因素对试验结果的影响，提高试验结果的可信度。信度。.设置比照：设置比照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的试验时，落数目的试验时，A A同学从对应的同学从对应的106106 倍稀释的培育基中筛选出大约倍稀释的培育基中筛选出大约150150个个菌菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其缘由。个菌落。分析其缘由。缘由：缘由：土样不同，土样不同，培育基污染或操作失误培育基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质
10、或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，试验结果小结：通过这个事例可以看出，试验结果要有劝服力，比照的设置是必不行少的。要有劝服力，比照的设置是必不行少的。方案一：由其他同学用与方案一：由其他同学用与A A同学相同土样进行试验同学相同土样进行试验 方案二：将方案二：将A A同学配制的培育基在不加土样的状同学配制的培育基在不加土样的状况下进行培育，作为空白比照，以证明培育基是况下进行培育，作为空白比照，以证明培育基是否受到污染。否受到污染。结果预料：假如结果与结果预料：假如结果与A A同学一样，则证明同学一样，则证明A A无误；无误；假如结果不同，则证明假如结果不同，则证明A A
11、同学存在操作失误或培育同学存在操作失误或培育基的配制有问题。基的配制有问题。二二.试验的具体操作试验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、潮湿的土壤中取样。先铲去从肥沃、潮湿的土壤中取样。先铲去表层土表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在运用前都要灭菌。运用前都要灭菌。.制备培育基：制备培育基：制备以尿素为唯一氮源的选择培育基。制备以尿素为唯一氮源的选择培育基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶
12、液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释.取样涂布取样涂布试验时要对培育皿作好标记。注明培试验时要对培育皿作好标记。注明培育基类型、培育时间、稀释度、培育物育基类型、培育时间、稀释度、培育物等。等。.取样涂布取样涂布分别不同的微生物接受不同的稀释度分别不同的微生物接受不同的稀释度缘由：不同微生物在土壤中含量不同缘由：不同微生物在土壤中含量不同.微生物的培育与视察微生物的培育与视察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培育时间不足而导致遗漏菌
13、落的数防止因培育时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。培育不同微生物往往须要不同培育温度。培育不同微生物往往须要不同培育温度。细菌：细菌：30303737培育培育1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培育培育5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培育的温度下培育3 34d4d。假如得到了假如得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，假犹如一稀释倍数并能够进行菌落的计数，假犹如一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不的三个重复的菌落数相差较大，表明试验
14、不精确，须要重新试验。精确，须要重新试验。微生物的培育与视察微生物的培育与视察三三.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过比照试验，若培育物有杂菌污通过比照试验，若培育物有杂菌污染，菌落数偏高；若培育物混入其他染，菌落数偏高；若培育物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。难以选择出分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较
15、大，菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。表示试验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五.课外延长课外延长 在以尿素为唯一氮源的培育基中在以尿素为唯一氮源的培育基中加入酚红指示剂。培育某种细菌后，加入酚红指示剂。培育某种细菌后，假如假如PHPH上升，指示剂将变红，说明上升，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将确定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将确定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将确定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将确定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放
16、到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培育培育培育培育基上培育，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出基上培育，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出基上培育，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出基上培育，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题学问小结本课题学问小结:六、例
17、题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定正确的表述是对细菌群体生长规律测定正确的表述是A A在液体培育基上进行在液体培育基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D刚好补充消耗的养分物质刚好补充消耗的养分物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在确定条件下进行的。解析：细菌群体生长规律的测定是人们在确定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培育基，液体培育基、定时这些条件是：一种细菌、恒定容积的培育基，液体培育基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定
18、时只能用一种细菌的子细胞群体的变更规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变更规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物供应确定的生存环境；液体培育基才能通过恒定容积是给微生物供应确定的生存环境；液体培育基才能通过样品推想细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推想细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证确定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证确定的接种量。答案：答案：A A1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培育基上进行在液体培育基上进行
19、B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.刚好补充消耗的养分物质刚好补充消耗的养分物质 2.2.运用选择培育基的目的是（运用选择培育基的目的是（）A.A.培育细菌培育细菌 B.B.培育真菌培育真菌 C.C.使须要的微生物大量繁殖使须要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区分表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区分3.3.能合成脲酶的微生物所须要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所须要的碳源和氮源分别是()A.CO2 A.CO2和和N2 B.N2 B.葡萄糖和葡萄糖和NH3NH3 C.CO2 C.CO2和尿素和尿素 D.D
20、.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分别到耐高温的度热泉中分别到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置比照试验的主要目的是解除试验组中非测试因设置比照试验的主要目的是解除试验组中非测试因素对试验结果的影响，提高试验结果的可信度素对试验结果的影响，提高试验结
21、果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培育和分别出酵母菌并淘汰杂菌，常在培育基中加为培育和分别出酵母菌并淘汰杂菌，常在培育基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C练一练练一练用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（其结果与实际值相比（）A.比实际值高比实际值高B.比实际值低比实际值低C.和实际值一样和实际值一样D.比实际值可能高也可能低比实际值可能高也可能低下列能选择出分解尿素的细菌的培育基是()A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水1