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1、氧化低密度脂蛋白 诱导巨噬细胞 在氧化型低密度脂蛋白诱导细胞凋亡中的作用和卡托普利的干预作用 摘 要 目的 探讨ox_LDL受体LOX_1在ox_LDL诱导单核/巨噬细胞 凋亡中的角色和卡托普利的干预作用。方法 应用流式细胞术检测细胞 凋亡，采纳免疫组织化学技术和Western Blot测定Caspase3、8、9的表达。结果 ox_LDL可诱导U937细胞的凋亡峰出现(12.7731.413)，应用卡托普利和LOX_1的 阻断剂角叉菜胶、PIA后凋亡峰明显削减，其百分比分别为(1.020.166)(4.940.47) (2.620.656)，同时U937细胞在用ox_LDL培育后代表线粒体通
2、路的Caspase9，3和代表死 亡受体通路caspases8,3表达都增加，应用卡托普利和LOX_1的阻断剂角叉菜胶、PIA后caspa se3、8、9的表达均削减。结论 ox_LDL是通过与其受体LOX_1结合发挥损 伤作用的。卡托普利可以抑制ox_LDL对U937细胞凋亡的诱导作用，从而对单核巨噬细胞起到 爱护作用。 关键词 LOX_1；U937细胞；ox_LDL；凋亡；卡托普利 中图分类号：R363 文献标识码 ：A 文章编号：1009_816X(2007)03_0164_04 The Effect of LOX_1 on U937 Cell Apoptosis Induced by
3、Oxidized LDL an d the Protective Effect of Captopril. QI Yan-hong, ZHENG Yang. Depart ment of Cardiology, The First Clinical Hospital of Jilin Universityf, Jilin 1300 21, China Abstract Objective To investigate the effect of LOX_1 on U93 7 cell apoptosis induced by oxidized LDL and the protective ef
4、fect of Captopril. Methods U937 cells were preincubated with different LOX_1 inhib itors and captop ril for 1 hour, then incubated with ox_LDL 100ug/ml for 24 hours. The change of apoptosis and proteolytic enzymes was observed. The degree of U937 cell apoptosi s was determined by flow cytometry. The
5、 expression of caspase 3, 8 and 9 was det ected by immunohistochemistry and Western Blot. Results Incubati on U937 cell with ox_LDL can induce U937 cell apoptosis and significant upregula te the expression of caspase 3, 8 and 9. Preincubation U937 cell with LOX_1 inhi bitors PIA, carrageenan and cap
6、topril for 1 hour could significantly suppresse U 937 cell apoptosis induced by ox_LDL and restraine the increase of caspase 3,8 a nd 9 (P0.05). Conclusions LOX_1 played a key role on U937 cell apoptosis induced by ox_LDL. Ox_LDL/LOX_1 interaction on U937 cell can ind uce apoptosis via death recepto
7、r and mitochondria pathway. Captopril can protect U937 cell from ox_LDL induced apoptosis. Key words U937 cell; ox_LDL; LOX_1; Captopril 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low_density lipoprotein receptor, ox _LDL)是致动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的一个重要的危急因素，试验证明ox_LDL以 时间浓度依靠诱导U937细胞的凋亡从而促进泡沫细胞的形成，促进AS的发生，发展1 。血凝素样氧化低密
8、度脂蛋白受体(lectin_like oxidized low_density lipoprotein r eceptor LOX_1)是新近发觉的一种ox_LDL受体，主要存在于内皮细胞的表面，它可以中和降 解ox_LDL，进一步引发斑块内细胞凋亡、基质的降解和炎症反应等导致动脉粥样斑块破 裂和血栓形成。探讨表明LOX_1在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表面都有表达2 。并且在ox_LDL的作用下U937细胞表面LOX_1的表达明显增加3，本文探讨LOX_ 1与U937细胞凋亡的关系和卡托普利的干预作用。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验仪器：二氧化碳孵箱(PKI日本)，倒
9、置显微镜(物镜10或20，目镜10)(H und D-6330Wetzlar21德国)，超净工作台(SW-CT-EFD苏州)，恒温水浴箱(H2S-H哈尔滨)，低 温台式离心机(AERMLE2383K德国)。 1.1.2 试验试剂：人骨髓系白血病细胞U937由吉林高校基础免疫教研室馈赠，低密度脂 蛋白(nLDL)和氧化低密度脂蛋白(ox_LDL)购自北京协和医院基础探讨所。IMDM培育基(PH7. 2，100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素)(Sigma Chemical Co. USA)，10%胎牛血清，D-Hank s液，其他试剂为国产分析纯，Caspase3、8、9单克隆抗体均购自S
10、anta Cruz公司。其它二 抗和显色剂购自鼎国公司。LOX_1拮抗剂聚肌苷酸(Polyinosinic acid PIA)和角叉菜胶购自 Sigma公司。卡托普利纯品(中美上海施贵宝公司馈赠)。 1.2 试验方法 1.2.1 细胞培育及试验分组 用IMDM培育液和10%胎牛血清，常规方法培育U937细胞，23d传代，待细胞传至须要数量时 即可用于试验。试验共分六组：(1)比照组：细胞置IMDM培育基中于5%CO2、37、饱和湿 度 培育箱中培育。(2)LDL组(nLDL):在培育瓶中加入nLDL(100ug/ml)，其他同比照组。(3)ox_L DL组：在细胞的培育瓶中加入ox_LDL(1
11、00ug/ml)，然后在IMDM培育基中于5%CO2、37、 饱 和湿度培育箱中培育24小时。(4)PIA组：PIA(250ug/l)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共 同培育24小时。(5)角叉菜胶组：角叉菜胶(250ug/l)处理后ox_LDL 100ug/ml共同培育24小 时。(6)卡托普利组：卡托普利(10-5mol/L)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共同培 育24小时。 1.2.2 流式细胞术(FCM)检测凋亡：分组分瓶收集细胞(1106个)。离心(1000r/min)5 min弃上清液，沉淀中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，离心(1000r/m
12、in)5min。弃上清液， 加75%冷乙醇2ml固定，置4保存。染色前用PBS离心沉淀去除固定液，加入20l RnaseA 3 7水浴30min，再加800l碘化吡啶染色液混匀，4避光30min。上机检测。 1.2.3 免疫组织化学技术检测caspase蛋白的表达：分组收集细胞，进行免疫组织化学染 色。以PBS代替一抗作为阴性比照，以已知的阳性片作为阳性比照。上镜视察阳性细胞数。 结果判定：阳性染色为细胞浆和(或)细胞核内有浅至深棕黄色颗粒，随机选择10个高倍视野 (400)，记数1000个细胞中所占的阳性细胞数，计算百分比。 免疫印迹法(Western Blot)检测caspase蛋白的表达
13、：取1106个培育U937细胞洗涤，离 心，用加样缓冲液裂解细胞，100水浴10min，离心(10 000r10min)，收集上清，采纳考 马斯亮兰法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80冰箱保存备用。用20ug蛋白/泳道上样 ， 经12%聚丙烯酰胺凝胶SDS_PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜。室温封闭3h加1：100 caspas e蛋白的抗体，再加入1：200的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，采纳二甲基 联苯胺(DAB)显色试剂盒进行显色约25min，待蛋白条带显色清楚时中止反应，拍摄照片， 记录试验结果。 1.3 统计学处理 各种计量数据均以均数标准差表示，各组数据间
14、显著性检验采纳t检验，统计学分析应用S AS(6.12)软件包。P0.05为有显著性差异。 2 结果 2.1 各U937细胞凋亡率 各组细胞经流式细胞仪检测DNA周期的结果发觉，正常培育的细胞DNA多处于G0/G1期，凋亡 率为(0.0980.022)%，而ox_LDL处理的细胞DNA在G0/G1期前出现了明显的“亚二倍体峰 ”，又称凋亡(AP峰)，凋亡率为(12.771.41)%。卡托普利组与C组相比凋亡率增加，为( 1.020.166)%；与ox_LDL组相比，凋亡率削减。应用LOX_1阻断剂PIA和角叉菜胶后，凋 亡率分别为(4.940.47)%和(2.620.656)%与C组相比凋亡率
15、增加，与ox_LDL组相比凋 亡率减低，差异均具有统计学意义(P0.05)。 2.2 LOX_1对凋亡蛋白酶的影响和卡托普利的作用 正常状态下，细胞核为圆形，周边整齐光滑，胞质和胞核内未见有棕黄色着色，经ox_LDL处 理 24小时后细胞体积缩小、细胞核出现凹沟，有的细胞核分裂成数个小核，符合细胞凋亡的光 镜学特征，在Caspase3、8、9染色的细胞核内均可见棕黄色颗粒着色，其阳性细胞百分率与 比照组明显增多(P0.05)。应用药物和阻断剂后可见细胞数目增多，与ox_LDL相比Ca spase3、8、9表达明显削减(P0.05)，见表1。 同时应用免疫印迹法发觉ox_LDL作用U937细胞2
16、4小时后caspase3、8、9的免疫印迹条带的颜 色明显加深，密度增加，其蛋白质的表达量明显增多，应用药物卡托普利和LOX_1阻断剂PIA 和角叉菜胶可见其含量明显削减(图1)。 3 探讨 大量探讨证明ox_LDL在动脉粥样硬化的形成和发展中扮演重要角色，而血管细胞通过受体介 导的方式中和降解ox_LDL。1997年Sawamura等4证明这一功能受体为血凝素样氧 化低密度脂蛋白受体(LOX_1)，它属于II型单链跨膜蛋白，有一个短的N端胞浆亲水结构和一 个 长的C端胞外亲水结构域，中间为疏水区域，从结构上看属于C型选择素家族。LOX_1作为ox_ LDL的受体与以往的清道夫受体(如CD36
17、)不同，它具有高度的配体特异性，可以结合、内吞 、 降解ox_LDL，但对自然低密度脂蛋白(nLDL)和乙酰化低密度脂蛋白(ac_LDL)则无作用 5，表明ox_LDL与LOX_1的结合是特异的，此过程可被LOX_1阻滞剂PIA和角叉菜胶抑制6。正常条件下主动脉内膜和富含血管的器官如胎盘，肺，脑，肝等中都有LOX_1的 表达，在胸主动脉的动脉粥样斑块中和培育的主动脉内皮细胞，巨噬细胞，血管平滑肌细胞 也有此表达2。 已有探讨证明ox_LDL诱导斑块内多种细胞凋亡都有LOX_1的参加。双重免疫斑点试验证明LOX _1表达与凋亡共存在7，其主要集中在斑块中有裂开倾向的区域。在培育的牛主 动脉平滑肌
18、细胞8，ox_LDL通过使受胞外信号调控的激酶磷酸化，从而上调LOX_1 介导凋亡，LOX_1中和抗体可阻挡细胞通过LOX_1对ox_LDL的摄取从而抑制ox_LDL诱导凋亡过 程，该抗体也抑制由ox_LDL引起Bax/Bcl-2的增加，因此ox_LDL通过LOX_1调整Bax/Bcl-2比 例诱导SMC 凋亡。把人脐静脉内皮细胞与抗Fas抗体激烈剂CH11和低浓度ox_LDL共孵育测凋亡，发觉ox_ L DL浓度依靠性上调Fas的表达，从而促进Fas介导的凋亡，LOX_1中和抗体则阻挡LOX_1介导的 对ox_LDL的摄取，从而抑制凋亡。因此ox_LDL通过与LOX_1相互作用上调细胞表面F
19、as，调整 Fas系统介导凋亡，从而通过死亡受体途径诱导凋亡9。在人冠状动脉内皮细胞， Li等6发觉与ox_LDL共孵育24小时LOX_1蛋白质和mRNA表达明显增加，而与nLDL共 同培育则无此现象，这种上调作用可被反义LOX_1抑制，但不被顺义LOX_1所抑制，PIA和角 叉菜胶也降低ox_LDL介导的凋亡。 在粥样斑块内尚存在巨噬细胞凋亡，然后坏死，使脂核不断增大，同时巨噬细胞凋亡使其对 脂质，胆固醇消退削减，促进AS的发生发展。ox_LDL可诱导巨噬细胞凋亡的发生，可诱导细 胞表面LOX_1的表达，但LOX_1与巨噬细胞凋亡的关系探讨较少。探讨证明在ox_LDL可时间和 浓度依靠性诱导
20、U937细胞凋亡和LOX_1的表明1，3，本文应用LOX_1的化学阻断剂 PIA的角叉菜胶探讨LOX_1在这一过程中的作用，结果表明LOX_1阻断剂可使ox_LDL诱导U937 细胞凋亡百分比削减，同时凋亡蛋白酶caspase3、8、9表达均削减。在细胞凋亡中的信号通 路及通路分子中，目前认为主要通过两条信号通路发生，一条是通过Fas和Fas配体激活天冬 氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶8(Caspase8)和3(Caspase3)的死亡受体途径，另一条是通过细胞 色素C释放进而逐步激活天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)和3(Caspase3)的线粒 体途径。本试验结果显示U937细胞
21、通过LOX_1摄取ox_LDL进而诱导细胞凋亡，应用LOX_1阻断 剂后Caspase8，9，3的表达削减，提示ox_LDL通过与LOX_1结合后是通过上述两条信号通路 诱导U937细胞凋亡现象的发生。 肾素_血管惊慌素_醛固酮和动脉粥样硬化发生和发展之间有着亲密的联系10，有 探讨证明血管惊慌素(Ang)II可上调LOX_1的表达11，ACEI为血管惊慌素转换酶抑 制剂，它可抑制AngI向AngII的转换，从而使LOX_1的表达削减。本文在培育液中预先加入AC EI类代表药物卡托普利，发觉ox_LDL诱导的U937细胞的凋亡现象明显削减，免疫组织化学染 色亦证明应用卡托普利处理后细胞凋亡蛋白
22、酶表达明显削减，表明卡托普利可抑制ox_LDL对 U937细胞的损害作用，其详细机制尚待进一步探讨。 总之，ox_LDL是导致AS的重要的危急因子，ox_LDL与其受体LOX_1结合通过以caspase为代表 的两条信号通路引起U937细胞凋亡，促进AS的发生、发展，ACEI类药物卡托普利则可通过抑 制ox_LDL的上述作用，起到抗动脉粥样硬化作用，这为我们对AS的发生发展机制的探讨及其 防治方法供应新的思路。 参考文献 1齐艳红，郑杨，王凌云.氧化低密度脂蛋白对U937细胞凋亡的影响及其机制的 探讨.中国心血管杂志，2005，4：255-257. 2Kume, N, Moriwaki H,
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