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1、三七总皂苷对缺氧再给氧血管内皮细胞钙离子浓度及肌浆网Ca2+-ATP酶活性的影响|血管内皮细胞灭活及清除超氧阴离子 摘 要：目的：探讨人脐静脉内皮细胞株（ECV304）缺氧再给氧（H/R）损伤的发朝气制及三七总皂苷（tPNS）对该病理生理过程的影响。方法：将体外培育的ECV304分为七组，正常组；模型组；tPNS高、中、低浓度组；维拉帕米组；吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）组，对各组进行相应处理后，分别检测各组细胞内钙离子浓度Ca2+i、肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮（NO）及前列环素（PGI2）含量、细胞活力的改变。结果：模型组、tPNS高、中、低浓度组、维拉帕米组及PDTC组肌浆网
2、Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮（NO）及前列环素（PGI2）含量、细胞活力明显低于正常组，Ca2+i明显高于正常组，其中tPNS高、中、低浓度组、维拉帕米组及PDTC组肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮（NO）及前列环素（PGI2）含量、细胞活力明显高于H/R组，Ca2+i明显低于H/R组，且呈浓度依靠性变更，tPNS高浓度组肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮（NO）及前列环素（PGI2）含量、细胞活力明显高于维拉帕米组及PDTC组，Ca2+i明显低于维拉帕米组及PDTC组。结论：H/R可激活ECV304，使细胞肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮（NO）及前列环素（PGI2）含量
3、、细胞活力明显降低，Ca2+i明显上升；tPNS能有效改善肌浆网Ca2+-ATP酶活性，减轻细胞内钙超载，减轻H/R损伤，且高浓度tPNS效果优于维拉帕米、PDTC。 关键词：人脐静脉内皮细胞株ECV304；缺氧再给氧损伤；钙离子；Ca2+-ATP酶；三七总皂苷 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0758-03 Abstract:Objective:To study the mechanisms of ECV304 with hypoxia/reo- xygenation（H/R） injury and the effect of tota
4、l panax notoginseng saponins （tPNS） on the pathophysiologic process. Methods:Divided the culture ECV304 to 7 groups,control group；H/R group；high，middle and low concentrations of tPNS group；Verapamil group；PDTC group.Every group are taked corresponding disposition.The ECV304 Ca2+i，sarcoplasmic reticu
5、lum Ca2+-ATP ase were detected，The content of NO and PGI2，Cell viability were measured. Result:The cell of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATP ase，content of NO and PGI2，Cell viability in H/R group，high，middle and low concentrations of tPNS group，Verapamil group，and PDTC group were significantly lower t
6、han that in control group.The levels of Ca2+i in H/R group，high，middle and low concentrations of tPNS group,Verapamil group，and PDTC group were significantly higher than that in control group, but the cell of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATP ase，content of NO and PGI2，Cell viability in high，middle an
7、d low concentrations of tPNS group，Verapamil group，and PDTC group were significantly higher and the levels of Ca2+i Was significantly lower than that in H/R group（P Key words:ECV304；hypoxia/reoxygenation；Calcium ion；Ca2+-ATP ase；total panax notoginseng saponins 探讨表明，钙超载是血管内皮功能损伤的重要机制之一1。再灌注时，活性氧增多、钙
8、超载、白细胞的粘附聚集及能量衰竭相互影响，共同促使内皮细胞的损伤。三七总皂甙（ total panax notoginseng saponins，tPNS）是我国中药田三七的主要药用成分，对心血管系统有着广泛的药理作用，具有对抗心肌缺血再灌注损伤、钙拮抗、心肌爱护作用、抑制心肌肥大和心室重构以及抗心律失常等2作用，但其作用机制并不完全明确。本探讨以人脐静脉内皮细胞株（ECV304）为探讨对象，模拟心肌缺血再灌注环境，通过检测血管内皮细胞缺氧再给氧损伤（ hypoxia/ reoxygenation , H/ R）后细胞内钙离子浓度Ca2+i、肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮（nitric
9、 oxide，NO）、前列环素（prostacyclin，PGI2）、细胞活力（Cell viability）的改变及tPNS干预后Ca2+i、Ca2+-ATP酶活性、NO、PGI2和细胞活力的改变，探讨tPNS对缺氧再给氧内皮细胞爱护作用的机制，为缺血再灌注供应中医药治疗的方法。 1 材料与试验方法 1.1 细胞株及培育液 ECV304细胞株（中山高校细胞库）；RPMI-1640培育基（美国GIBCO）；胎牛血清（美国GIBCO）。 1.2 主要试剂与仪器 三七总皂苷（广东永康药业有限公司，批号0705011），NO、PGI2及肌浆网Ca2+-ATP酶活性测定试剂盒（南京建成生物工程探讨所）
10、，MTT（美国Sigma公司），flour-3/AM（美国Biotium），流式细胞仪（美国BECKMAN COULTER公司ALTRA型），四色荧光，配套EXPO32采集分析软件，MultiCycle分析软件。试验于广州中医药高校第一临床学院中心试验室完成。 1.3 细胞培育及分组 将ECV304细胞接种于24孔板，于10%胎牛血清的RPMI-1640培育基培育，待细胞生长至稳定状态（约24h），将培育的ECV304细胞分为7组，正常组：未予H/R及药物干预处理；模型组：予H/R处理；三七总皂苷高剂量组：3.1251mg/L；三七总皂苷中剂量组:1.5631mg/L；三七总皂苷低剂量组：0.
11、781mg/L；吡咯烷二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）组：PDTC 100umol/L；维拉帕米组：100umol/L维拉帕米；除正常组、模型组外的其余五组分别与药物共同孵育1h后制作H/R模型。 1.4 H/R模型的制作 将生长至稳定状态的ECV304细胞置于37、5%CO2 、95%空气的培育箱正常培育1h，放入37、5%CO2 、95% N2的培育箱培育1.5h，取出置于37、5%CO2 、95%空气的培育箱正常培育32h，用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA-Na2混合液消化收集各组细胞。 1.5 NO PGI2测定 收集各组
12、细胞培育上清液，按试剂盒操作步骤测定NO、PGI2含量。 1.6 肌浆网肌浆网Ca2+-ATP酶活性测定 收集各组细胞，制备肌浆网4，按试剂盒操作步骤测定肌浆网Ca2+-ATP酶活性。 1.7 流式细胞仪检测Ca2+i浓度 收集的单个细胞，PBS洗两次,离心去上清，加入终浓度为5mol/mL flour-3/AM，混匀，37避光孵育40min后，用无钙PBS洗涤2次，用无钙PBS悬浮现机。 1.8 MTT比色法检测细胞活力 将配制成5105/mL的单细胞悬液，接种于96孔培育板内，每组八孔培育24h，各组进行不同处理后，每孔加MTT20L，孵育4h，终止培育，弃培育液。每孔加入100L二甲基亚
13、砜振荡10min，待结晶溶解，酶标仪测定吸光度（A）值，选波长为492nm。 1.9 统计学分析 SPSS 11.5统计分析软件对数据进行处理，各组数据均采纳均数标准差表示，两组比较采纳t检验，P 注：NO、PGI2测定，与正常组比较，&P、*P、*P、*P、#P、#P0.05；与模型组比较，*P、*P、*P、#P、#P0.05，与高剂量组比较，*P、*P、#P、#P0.05。Ca2+i、Ca2+ATP酶活性测定，与正常组比较，&P、*P、*P、*P、#P、#P0.05；与模型组比较，*P、*P、*P、#P、#P0.05；与高剂量组比较，*P、*P、#P、#P0.05。细胞活力，与正常组比较，
14、&P、*P、*P、*P、#P、#P0.05；与模型组比较，*P、*P、*P、#P、#P0.05；与高剂量组比较，*P、#P、#P0.05。 NO是血管内皮释放的重要的舒血管因子，具有扩张血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌细胞增殖等爱护作用10。缺血再灌注引起内皮细胞损伤，可使内皮细胞合成和分泌的多种血管活性物质和细胞因子间的平衡遭到破坏：NO、PGI2的合成削减或生物活性降低，内皮素的合成增加，内皮介质平衡失调，导致内皮调整血管张力、抗血小板聚集和白细胞黏附、抗凝血和血栓形成等功能障碍11，加重缺血再灌注损伤。本探讨结果显示：缺氧再给氧可损害细胞活性及其分泌NO、PGI2功能，用三七总皂苷预处理后
15、，可明显改善细胞活性及其分泌NO、PGI2功能，且呈浓度依靠性，表明三七总皂苷能明显改善内皮细胞活力，改善内皮细胞分泌功能，减轻缺氧再给氧损伤。与钙拮抗剂维拉帕米、抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸脂相比，高浓度三七总皂苷作用较强，提示三七总皂苷能有效改善内皮细胞分泌功能，减轻缺氧再给氧损伤。 参考文献 1 肖桂凤，宁钢民，葛亚坤等.葛根素对培育人脐静脉内皮细胞钙超载的影响J.中国药理学通报，2005，21（11）：1388-1392. 2 徐辉.三七总皂苷对心血管系统的影响及作用机制J.现代中西医结合杂志，2006，15（19）：2720-2722. 3 Kim CD, Kim YK, Lee SH
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