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1、胰岛素、血管紧张素对人血管内皮细胞-的激活和血脂康干预的影响|血管紧张素II 摘 要 目的 视察胰岛素、血管惊慌素II(Ang II)对体外培育的 人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)NF_ B的激活及 血脂康干预后的影响。方法 体外培育人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)，2 3代用于试验。细胞用0.5%胎牛血清培育液培育24小时后分成七组；正常比照组、胰岛素组 (100uI /ml)、Ang II组(510-8mol/ml)、胰岛素+Ang II组、胰岛素+血脂康组(150ug/ml) 、Ang II+血脂康组、胰
2、岛素+Ang II+血脂康组。加血脂康的各组，血脂康预先孵育2h，再 加胰岛素或/和Ang II共同孵育。在4h时间点上，分别用免疫细胞化学方法测各组内皮细胞N F_ Bp65的核易位阳性率，用免疫荧光和流式细胞仪检测其活性。结果 胰岛素、Ang II、胰岛素+Ang II刺激4h后，内皮细胞NF_ Bp65的核易位阳性率(%)分别 为95.53、96.63、96.44，显著高于比照组(4.52)(P0.05)，血脂康几 乎完全抑制胰岛素、Ang II、胰岛素+Ang II所致的NF_ Bp65核易位阳性率的增加(7.3 3、6.94、6.32)(P0.05)。胰岛素、Ang II、胰岛素+A
3、ng II刺激4h后， 内皮细胞NF_ B活性分别为6.550.53、7.230.36、10.290.69，显著高于比照 组(3.260.37)(P0.05)；与单用胰岛素或Ang II比，胰岛素+Ang II使NF_ B活 性增加更明显(P0.05)；血脂康能明显抑制NF_ B的活性(4.440.49、3.980 .24、5.020.39)(P0.05)。结论 胰岛素、Ang II均能激活内 皮细胞NF_ B，促进NF_ Bp65的核易位，有致动脉粥样硬化(AS)作用。血脂康能抑制内 皮细胞NF_ B的激活，具有调脂外的抗AS作用。 关键词 胰岛素；血管惊慌素II；内皮细胞；核因子- B；血
4、脂 康 中图分类号：R458.5 文献标识码：A 文章编号：1009_816X(2007)03_0 161_03 The Effect of Insulin and Angiotensin II on Nuclear Factor-kB Activat ion in human Endothelial cells and the Influence of Xuezhikang Intervention. NIE Zhi-hua, HUANG Shao-lie, HUANG Xiu-zhen, et al. The Second Hospital of Xiamen, Fujian 361026
5、, China Abstract Objective To observe the effect of insulin and angi otensin II (Ang II) on nuclear factor_kB (NF_ B) activation and the influence of Xuezhikang intervention. Methods Cultured ECV-304 cells (huma n umbilical vein endothelial cell strain) were incubated with 0.5% FBS for 24 h r, then
6、divided randomly into seven groups. Except the control group, the other six groups were treated by insulin (100ul/ml), Ang II (510-8mol/ml), ins ulin+Ang II, insulin+Xuezhikang (150ug/ml), Ang II+Xuezhikang, insulin+A ng II+Xuezhikang. Cells were incubated with Xuezhikang for 2 hr before co_incu bat
7、ed with insulin or /and Ang II in the groups containing Xuezhikang. After co_ incubation for 4 hr, immunocytochemical method was employed to evaluate nuclear translocation of NF_ B subumit p65; NF_ B activity was measured by fluoresce nt labeling and flow cytometry. Results 1.After treatment for 4h,
8、 insulin or Ang II or insulin+Ang II stimulated nuclear translocation of NF_ B , Xuezhikang could almost completely inhibit this change. 2. NF_ B activity of control group (3.260.37) was lower than that of groups stimulated by insuli n(6.550.53)or Ang II (7.230.36) or insulin+Ang II (10.290.69)(P 0.
9、05); insulin+Ang II elevated NF_ B activities more effectually than insulin or Ang II alone (P0.05). However, pro_incubated with Xuezhikang for 2hr NF_ B activity was obviously decreased (4.440.49, 3.980.24 and 5.02 0.39, respectively. P0.05). Conclusions Both insulin an d Ang II activate NF_ B, so
10、was pro_atherosclerosis, Xuezhikang exihibited the ability to inhibit activation of NF_ B induced by insulin or Ang II, which de monstrated that Xuezhikang has protective effect on anti_atherosclerosis indepen dent of cholesterol_lowering effect. Key words Insulin; Angiotensin II; Endothelial cell;
11、NF_ B; Xuezhikang 动脉粥样硬化(AS)是一种炎症性疾病1，NF_ B在其发病机 制中起重要作用2，本试验采纳胰岛素、Ang II刺激培育的血管内皮细胞，视察 在4h时间点血管内皮细胞NF_ B的活性及血脂康干预的影响，探讨胰岛素、Ang II致AS的 机制和血脂康抗AS的作用机理35。 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂：人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)冻存管购自中国科学院上海细胞生 物探讨所；胎牛血清购自杭州四季青公司；RPMI-1640培育基及胰蛋白酶购自美国Gibco公司 ；血管惊慌素II粉剂购自美国Sigma公司；血脂康原粉由北大维信生物科技有限公司惠赠； 短
12、效人胰岛素购自诺和诺德中国制药有限公司；鼠抗人NF_ Bp65单克隆抗体购自美国Sant a Cruz Biotechnology公司；免疫组化染色ABC试剂盒、DAB显色试剂盒及羊抗鼠FITC二抗均 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.2 细胞复苏、培育及分组：细胞按常规方法复苏、传代、培育，复苏后23代用于试验 。试验分比照组、胰岛素组(100uI/ml)、Ang II组(510-8mol/ml)、胰岛素+Ang II 组、胰岛素+血脂康组(150ug/ml)、Ang II+血脂康组、胰岛素+Ang II+血脂康组。血脂康组 中血脂康预先孵育2h。 1.3 血管内皮细胞NF_ B核易位
13、阳性率5：在24孔培育板放入消毒好的盖玻片 ，加入1ml培育的内皮细胞悬液，细胞爬片后，换用含0.5%胎牛血清的培育液培育24小时， 使细胞同步后进行试验。试验试剂和药物按前述分组加入培育孔中与内皮细胞共同孵育4h后 ，行免疫细胞化学染色，方法严格按试剂盒操作说明进行，制片，封片，在显微镜下视察， 于 200倍镜下随机取5个视野，分别计算NF_ Bp65核易位阳性率(核易位阳性率核易位阳性 细胞/视野下细胞总数(核易位阳性细胞的判定：胞核以及靠近核膜的部分胞浆染色呈棕黄色 ，可见棕黄色颗粒沉积)。 1.4 流式细胞仪检测血管内皮细胞NF_ B活性6：培育板里的细胞用冷PBS洗 涤两次，用细胞刮
14、子刮落细胞，用PBS洗涤吹散混匀，移入离心管以1000rpm/min离心5分钟 ，细胞沉淀用1.0mlPBS洗涤吹散，移至Enppendorf管，1000rpm/min离心5分钟，弃上清， 收集细胞沉淀，加1.0mlPipes_Triton buffer吹打混匀细胞，在4孵育30分钟，4以120 00rpm/min离心5分钟，弃上清，用含10%FBS的PBS洗两次，412000rpm/min离心5分钟，弃 上清，向试管加入97.5l PBS，再加入2.5l NF_ Bp65一抗(终浓度5ug/ml)，比照管 加等量PBS，吹打混匀，4孵育45分钟，412000rpm离心5min，弃上清，用PB
15、S-FBS洗涤2 次，离心，弃上清，用PBS吹打匀称，加入FITC标记的兔抗小鼠IgG二抗，4孵育45分钟，P BS-FBS洗涤两次，移入1275的专用管中，上机检测。 1.5 统计分析：数据采纳SPSS11.5统计软件处理。试验数据以均值标准差(xs)表示，P0.05统计学上有显著性差异 。 2 结果 2.1 胰岛素、Ang II、血脂康对血管内皮细胞NF_ B核易位阳性率的影响：见表1。比照 组血管内皮细胞核内基本无黄染，即无NF_ Bp65核易位。胰岛素、Ang II刺激4小时后， 血管内皮细胞NF_ Bp64核易位阳性率明显增加，分别达(95.53)%和(96.63)%；胰岛 素和An
16、g II共同刺激4小时后，血管内皮细胞NF_ Bp65核易位阳性率达(95.44)%；与未 加血脂康各组比，加血脂康各组血管内皮细胞NF_ Bp65核易位阳性率明显降低。 2.2 胰岛素、Ang II、血脂康对血管内皮细胞NF_ B活性的影响：见表2。比照组内皮细 胞NF_ B的活性是3.260.37，胰岛素、Ang II刺激后内皮细胞NF_ B的活性明显增加 ，胰岛素+Ang组NF_ B的活性更强，与胰岛素或Ang II单独刺激组有明显差别，提示胰岛 素和Ang II对内皮细胞NF_ B的活性有协同作用。胰岛素+血脂康组、Ang II+血脂康组及 胰岛素+Ang II+血脂康组NF_ B的活
17、性，与对应的未加血脂康各组相比，NF_ B的活性均 明显降低(P0.01)。但仍未下降到比照组水平。 3 探讨 胰岛素致AS作用已被很多临床探讨证明。Ang II是RAS的主要成员之一，可通过多种机制 致AS作用，抑制Ang II的作用能有效降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。NF_ B是1986 年Sen和Baltimore首次从B淋巴细胞核抽提物中，检测到的一种能与免疫球蛋白轻链基因 增 强子 B序列特异结合的转录因子，诱导多种炎症因子的表达。在AS的病变部位，可见血管 平滑肌细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞内均有NF_ B的激活现象，其中内皮细胞NF_ B的 激活被认为是AS的起始事务。 本试
18、验显示，病理浓度的胰岛素(100uI/ml)刺激4h，能明显激活内皮细胞NF_ B，表现为 核易位阳性率上升，核内荧光强度增加。Ang II也能明显激活NF_ B，此与王海蓉的报告 相 一样5。本试验显示，胰岛素和Ang II对NF_ B激活有协同作用，胰岛素+Ang I I组与单用胰岛素或Ang II相比，尽管核易位率无显著差别，但流式细胞仪结果显示NF_ B 的活性有显著性增高差异。 在信号转导中NF_ B活化的经典途径是：刺激物-受体-受体连接蛋白-NIK-IKK-I B的磷 酸化降解-p65_p50的释放-p65_p50与DNA上 B位点结合-增加转录。其中I B磷酸化并与 p65_p
19、50解聚是NF_ B活化的必经之路。胰岛素具有多种生物学效应，探讨表明，胰岛素可 通过下述转导途径激活NF_ B：胰岛素-胰岛素受体-胰岛素受体底物_1-SHC-GRB2-SOS_1- Ras-PI3K-Akt/Cot-IKK-I B7。有探讨发觉胰岛素使AT2受体mRNA含量增加 ，使AT1mRNA半衰期延长8，使Gab_1表达降低从而使Ang II激活NF_ B作用增 强9，由于参加信号转导的分子种类繁多，之间相互激活形成困难的网络，所以 其准确机制尚不清晰。 本试验显示，很多粘附分子的表达是由NF_ B介导血脂康(150ug/ml)能显著拮抗胰岛素及A ng II对NF_ B的激活作用。
20、NF_ B的激活参加了AS发生、发展的整个病理过程，包括内皮细胞活化、 白细胞粘附、血小板的活化、平滑肌细胞表型转化和迁移、泡沫细胞的开成、胞外基质合成 与降解等。血脂康能抑制NF_ B的激活，表明它能在整个AS过程中发挥综合的心脑血管保 护作用。 参考文献 1Russell Ross. Atherosclerosis_an inflammatory disease. N Engl J Med, 1999, 304:115-126. 2Tak PP, Firestein GS. NF_kappaB: a key role in inflammatory diseases. The Journa
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