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1、本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 20XX 核酸检测基本知识 核酸检测基本学问 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过 3，5-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。核酸具有特别重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸 DN和核糖核酸RN。3.核酸的组成 DN 和 RN 都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由 C、H、O、N、P，5 种元素组成。DN 是绝大多数生物的遗传物质，RN 是少数不含 DN 的病毒如 HIV 病毒，流感病毒，SR
2、S 病毒等的遗传物质。RN 平均长度大约为 2000 个核苷酸，而人的 DN 却是很长的，约有 3X109个核苷酸。4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因此在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起确定性的作用。本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 DN 与 RN 都是核酸，它们在化学组成上有什么区分如下：DN 与 RN 的比较 DN RN 主要存在部位 细胞核 细胞质 基本组成单位 脱氧核苷酸 核糖核苷酸 碱基种类 、G、C、T 、G、C、U 五碳糖种
3、类 脱氧核糖 核糖 核苷酸链 两条脱氧核苷酸链 一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生 物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核酸检测。目前主要使用的方法有以下几种：.核酸序列依靠性扩增法 NSB 是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增 RN 的新技术。反应在 42进行,可在 2h 内将 RN 模板扩增约 109 倍。NSB 原理是提取病毒RN,加入 MV 逆转录酶、RN 酶 H、T7RN 聚合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物 I 与模板 R
4、N退火后在 MV 逆转录酶的作用下合成 cDN,形成 RN:DN 杂合体,随即RNseH降解 RN,引物与 cDN退火,在反转录酶作用下合成第 2条 DN 互补链。双链 DN 可在 T7RN 聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录 RN，RN 又可在反转录酶的作用下反转录成 DN，进本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 入循环相,对模板进行大量扩增。b.转录介导的扩增技术 TM 技术原理与 NSB 基本一致，略有不同之处是 TM利用的是MMLV逆转录酶及T7RN聚合酶两种酶，MMLV 逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有 RN 酶 H 活性。反应在4
5、1.5进行,可在 1h 内将 RN 模板扩增约 109 倍。c.连接酶酶促链式反应(LCR)LCR 是基于靶分子依靠的寡核苷酸探针互相连接的一种 探针扩增技术，是继 PCR 后新进展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由 2 段寡核苷酸单链 DN 探针与目标序列杂交,当该 2 段 DN 探针与没有发生突变的模板褪火后,假如 2 探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。d.多聚酶链反应检测法(PCR)PCR 技术的基本原理类似于DN 的自然
6、复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性退火延长三个基本反应步骤构成。模板 DN 的变性：模板 DN 经加热至 93左右肯定时间后，使模板DN双链或经 PCR扩增形成的双链 DN解离，使之成为单链，本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 以便它与引物结合，为下轮反应作预备。模板 DN 与引物的退火(复性)：模板 DN 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DN 单链的互补序列配对结合。引物的延长：DN 模板引物结合物在 TqDN 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制
7、原理，合成 1 条新的与模板 DN 链互补的半保存复制链，重复循环变性退火延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链，而且这种新链又可成为下次 循环的模板。每完成 1 个循环需 24min，23h 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测 HIVRN,需要先利用逆转录反应将 RN 转录为 cDN，继而以cDN 为模板进行 PCR 扩增即可，这样的反应称为 RT-PCR。e.实时荧光定量 PCR 技术 实时荧光定量 PCR 技术,是指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个 PCR进程,最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5端标记荧光
8、基团 R,3端标记淬灭基团 Q,在没有 PCR 扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当 PCR本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间,利用 Tq 酶的53外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时检测。该技术不仅实现了 PCR 从半定量到定量的飞跃,而且与常规 PCR相比,它具有特异性强、自动化程度
9、高、有效解决了 PCR 污染问题等特点。f.支链 DN 检测法bDN bDN 是定量检测血浆中的 HIV1 型 RN 的一种方法。bDN 是指人工合成的带有侧链的 DN 片段,在其每个侧链上 都可以标记被激发的标记物。将 HIV 的 RN 通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针 1 将其捕获到微孔中。捕获探针 2 与病毒 RN 的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即 bDN 探针杂交。两套靶探针分别与病毒 RN 的 pol 基因的不同区域特异结合。在微孔中形成 HIVRN寡核苷酸复合物。再加入 1 种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强
10、度与样品中 HIVRN 含量成比例。bDN 不存在扩增物的交叉污染,这较 PCR 是一大进步。本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 bDN 有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测 HIV 某些变异株,但灵敏度不及 PCR，提高 bDN 灵敏度是一大难点。检测步骤 HIV 核酸定性检测技术，其检测过程分为核酸提取、逆转录合成 cDN、PCR 扩增反应、扩增产物定性分和结果判定和完成报告单。6.试验室检测具体步骤如下：.核酸提取 使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分别方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取 RN 时应留意防止 RN 降
11、解。DN 应置于-20保存，RN 和需长期保存的 DN 应置于-80保存。b.逆转录合成 cDN 逆转录 cDN 合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RN 酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无 RN/DN酶的超纯水以及 RN 模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化 RT-PCR 一步法试剂进行第一轮扩增反应。逆转录 cDN 合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RN 酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无 RN/DN酶的超纯水以及 RN 模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。使用商品化 RT-PCR 一步法试剂进行本文格
12、式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 第一轮扩增反应。c.PCR 扩增反应 使用二次扩增的套式 PCR 扩增方法 PCR反应需使用引物、dNTPs、DN 聚合酶如 Tq 酶等、缓冲液、和适量无 RN/DN 酶超纯水、以及模板DN 或 cDN。在扩增仪中，根据设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式 PCR 扩增方法。e.扩增产物定性分析 扩增产物常用分析方法是 XX 脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，推断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及 DN 序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析
13、或荧光探针杂交等原理测定。f.结果判定和完成报告单 1试验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性 对比、两个阴性对比，只有阳性对比扩增出预期的片段、阴性对比没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的状况下试验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。2HIV 核酸检测阳性：发觉核酸阳性反应，应当重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第 1 页 共 1 页 3HIV 核酸检测阴性：只可报告本次试验结果阴性。4应在完成检测后 5 个工作日内发出检测报告。