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1、 对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 前言：PCR 技术的的运用，要点包括三部分，模板、引物和体系。模板是扩增的基础，引物是PCR技术的关键点，在现在实验条件下，模板和体系一般都有商品化的技术支持，因此，能否设计出好的引物就成了 PCR反映的关键 1.利用软件 Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌 DNA 序列进行酶切找到含目的基因的较小的片段 2.利用软件 Vector NTI Explore 进行引物设计引物 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段 DNA 序列。3.引物设计的原则：（1）长度在 1835bp，GC 含量在
2、 40%60%之间，内部无发卡结构，Tm 值接近 72；（2）引物之间避免形成二聚体；（3）引物 3端和模板之间不应少于 12 个连续碱基相匹配；（4）在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的 3端加上适当的酶切位点。（5）引物 3端不能选择 A，最好选择 T。（6）引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。实验内容：试验中用到的古生菌的序列长 12389bp，其中 80-709bp 是要得到的未知功能蛋白质的基因序列，利用 Vector NTI Explorer 分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离
3、目的 DNA 片段，最后得到 11429 的 DNA 片段，是理想的 PCR 模板。再次使用 Vector NTI Explorer 分析，设计 PCR引物，使用 PCR 扩增得到目的 DNA。实验步骤：1,要用限制性内切酶将多余的片段切去。找出目的基因所在的片段 712389 bpPst I(3370)ClaI(2372)ClaI(11744)HindIII(2494)HindIII(2828)HindIII(3066)HindIII(3884)HindIII(737 3)NcoI(4042)NcoI(6593)NcoI(7 47 2)NcoI(10443)NcoI(11425)EcoRI(
4、1429)EcoRI(2696)EcoRI(3259)EcoRI(5730)EcoRI(5748)EcoRI(6201)SmaI(7 369)SmaI(7 492)SmaI(7 560)SmaI(9182)SmaI(9210)SmaI(9867)SmaI(11687)X maI(7 367)X maI(7 490)X maI(7 558)X maI(9180)X maI(9208)X maI(9865)X maI(11685)Av a I(368)Av a I(7 367)Av a I(7 490)Av a I(7 558)Av a I(7 827)Av a I(8088)Av a I(880
5、1)Av a I(9142)Av a I(9180)Av a I(9208)Av a I(9597)Av a I(9865)Av a I(11344)Av a I(11434)Av a I(11685)Av a I(12094)这是 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA 序列利用软件 Vector NTI所能找到的所有酶切位点：由给出的切割位点课已看出，在整条基因序列中 PstI 的切割微点只有一个，所以首先用此限制酶切割，可以得到 3370bp 之前的整条片段。这样做既不会切断需要的那一段基因序列，又可以切除掉大部分的不需要的片段。切完后，进行琼脂糖凝胶
6、电泳法进行电泳，可以得到下图：11 300 700 2K5K10K20K100K10M在电泳过程中，DNA片段越大就跑的越慢，因为需要的是含有80-709bp的那一段，因此应当回收跑的快的那一段，即1-3370bp这一段 83370 bpAva I(368)Cla I(2372)PstI(3370)Eco RI(1429)Eco RI(2696)Eco RI(3259)Hin dIII(2494)Hin dIII(2828)Hin dIII(3066)，11 300 700 2K5K10K20K100K10M 得到1-3370bp这一段基因序列后如果再次进行切割，那么所有的酶切位点如上图所示。
7、未得到80-709bp片段就 可以 用EcoRI酶进行完全切割，这样 可以得 到1-1429bp、1429-2696bp、2696-3259bp、3259-3370bp这四个片段，长度为1429bp、1267bp、563bp、111bp，若为这样那么前两段长度相差很小，电泳时不易区分，于是要用ClaI进行双酶切隔。将1429-2696bp段 再 切 为 两段，长度分别为943bp、342bp，这样点勇士便于区分。可以比较容易的得到目的片段，即1-1429bp段。电泳如左图：同理可将1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶
8、切位点AvaI，如图。用工具找它的ORF，ORF的分析结80709bp处，91430 bpAva I(368)1 AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATT TTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101 GGAATGAAGA ATCTTTAT
9、AA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT GTATCAAAAT CCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GACCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA 201 ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTC
10、TAA AGTATAGAAA TATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TGACTGGATT TTTCCAGTCT TTTGCAAATG CTTTAAGATT TCATATCTTT AvaI 301 GGTAAAAGGG GGTTATATAA TTGACTTCCT TGAAGATCTG AGTACTACAA TTTCAGGATA TATACTCTCG AGCAGTAATA TATTAGAATA TAGAAATGTC CCATTTTCCC CCAATATATT AACTGAAGGA ACTTCTAGAC TCATGATGTT A
11、AAGTCCTAT ATATGAGAGC TCGTCATTAT ATAATCTTAT ATCTTTACAG 401 GTAAGGGAAG GAATAGAAAA GTGGGAAGTA ACAACTTTAG CCAAATCTTT AGTAGGCAAA TTATCAGAAA GATTTCCCAT AGATAGCATT GTAGTTAAAG CATTCCCTTC CTTATCTTTT CACCCTTCAT TGTTGAAATC GGTTTAGAAA TCATCCGTTT AATAGTCTTT CTAAAGGGTA TCTATCGTAA CATCAATTTC 501 AAATAAAGTT TTCAGAT
12、ATG TTCTATAATG GTTTGACAGA AAAGGAGATA CTAGTCCTAA AAACCGCAAT AACTATGGGA TATTTCAATT ATCCAAGGCA TTTATTTCAA AAGTCTATAC AAGATATTAC CAAACTGTCT TTTCCTCTAT GATCAGGATT TTTGGCGTTA TTGATACCCT ATAAAGTTAA TAGGTTCCGT 601 AATAAAAGCT AAGGAAATTG CTGAAAAATT AGGTATCTCC AAGCAAGATT TCCTTTATCA TCTGCGAAAA TCAATAGAGA AAATAA
13、TTTT CTCATCAGTT TTATTTTCGA TTCCTTTAAC GACTTTTTAA TCCATAGAGG TTCGTTCTAA AGGAAATAGT AGACGCTTTT AGTTATCTCT TTTATTAAAA GAGTAGTCAA 701 ATAGAATAGT AATTCATGCA TATTAAATTA CTAAAAATTT AAGTGATTAA AAAGGTTTAA AAATAATATA AGACTCCTTT ATATTCAAAG ACTATAATCA TATCTTATCA TTAAGTACGT ATAATTTAAT GATTTTTAAA TTCACTAATT TTTCC
14、AAATT TTTATTATAT TCTGAGGAAA TATAAGTTTC TGATATTAGT 801 CCGAACTTCT TAATTCTGTC TGGAAATCTG CTCTTTATCA CATAATATGT AATTATGTGA ATCAAAAGAA TAGCCCAAGC TGCATAAACT GCTATATTTA GGCTTGAAGA ATTAAGACAG ACCTTTAGAC GAGAAATAGT GTATTATACA TTAATACACT TAGTTTTCTT ATCGGGTTCG ACGTATTTGA CGATATAAAT 901 ATGGGAAAGC TGGCGCAGGG
15、TAAGTACCAA AATATATTAC AGCAATATAT AATAGTATTG AAATTATCGG TATCACTACG TGTTTCGCTA TGTTAGCCGT TACCCTTTCG ACCGCGTCCC ATTCATGGTT TTATATAATG TCGTTATATA TTATCATAAC TTTAATAGCC ATAGTGATGC ACAAAGCGAT ACAATCGGCA 1001 ACGCATTTTA ACCTTACGTA CAATTAACCC TAAGGCAGCA AATAAATGAC CTAAGGCGAC GTAGAATGAG CCAAATGTTA TTAAAAATA
16、T ACTAGCCTCT TGCGTAAAAT TGGAATGCAT GTTAATTGGG ATTCCGTCGT TTATTTACTG GATTCCGCTG CATCTTACTC GGTTTACAAT AATTTTTATA TGATCGGAGA 1101 AACGGACCTA GAATGTAACC ACTTATAAGG CTAAGAGCAC CTGTAACAAT ACCAGTAAGT ATTATTGCAT TACCCGGCAC ACCGTATTTA TTAACTTTTG TTGCCTGGAT CTTACATTGG TGAATATTCC GATTCTCGTG GACATTGTTA TGGTCAT
17、TCA TAATAACGTA ATGGGCCGTG TGGCATAAAT AATTGAAAAC 1201 AAAAGACTTT AGGATATAAT ACACCATCCC TAGCCATACC GAATATCATT CTACTCCCAC TAGTAGCAAA CGCTAATGCA GAAGAGTTAA ACATAAACGC TTTTCTGAAA TCCTATATTA TGTGGTAGGG ATCGGTATGG CTTATAGTAA GATGAGGGTG ATCATCGTTT GCGATTACGT CTTCTCAATT TGTATTTGCG 1301 TACAAGTATT ATTAACATAT
18、ATACAATAGC GGGATTGAAA TACTTACTAT AAATCACTAT CATTGGGTCT GGAAGATTAG CATAATTAAA CATATTATTT ATGTTCATAA TAATTGTATA TATGTTATCG CCCTAACTTT ATGAATGATA TTTAGTGATA GTAACCCAGA CCTTCTAATC GTATTAATTT GTATAATAAA 1401 ATTCCATAAA CTATCGTCTG CGCATAAGAA TAAGGTATTT GATAGCAGAC GCGTATTCTT 。2.酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的 5 端增加
19、酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。在 EcoRI 和 PstI 之间加上目的基因。在引物设计框中在正义链 5端加 PstI 酶切位点，在反义链加 EcoRI，根据引物设计原则修改参数，结果如下 PCR Analysis#1:Product of length 764(rating:171)Contains region of the molecule from 80 to 831 Tm:71.2 C TaOpt:51.0 C GC:29.7 Sense Primer:CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer withou
20、t 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:53.7 C GC:45.8 dH:-170.4 kcal/mol dS:-442.4 cal/mol dG:-36.7 kcal/mol Antisense Primer:GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAA Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:56.4 C GC:41.7 dH:-177.6 kcal/mol dS:-459.1 cal/mol dG:-38.9 kcal/mol Tm Difference:2.7 GC D
21、ifference:4.2#2:Product of length 765(rating:171)Contains region of the molecule from 80 to 832 Tm:71.2 C TaOpt:51.0 C GC:29.7 Sense Primer:CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:53.7 C GC:45.8 dH:-170.4 kcal/mol dS:-442.4 cal/mol dG:-36.7 kcal/mol Ant
22、isense Primer:GAATTC AGCAGATTTCCAGACAGA Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:54.2 C GC:41.7 dH:-170.2 kcal/mol dS:-441.0 cal/mol dG:-36.9 kcal/mol Tm Difference:0.6 GC Difference:4.2#3 Product of length 764(rating:171)Contains region of the molecule from 80 to 831 Tm:71.2 C T
23、aOpt:51.0 C GC:29.7 Sense Primer:CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:53.7 C GC:45.8 dH:-170.4 kcal/mol dS:-442.4 cal/mol dG:-36.7 kcal/mol Antisense Primer:GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAAT Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:25 Tm:56.8 C GC:40.0 dH:-186.2 kcal/mol dS:-483.0 cal/mol dG:-40.4 kcal/mol Tm Difference:3.1 GC Difference:5.8 3.根据引物设计原则，.选择合适的引物，进行 PCR 扩增，就得到大量目的 DNA片段。