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1、 HPLC 法测定酒石酸 Hessen was revised in January 2021 HPLC 法测定酒石酸 酒石酸又称 2,3-二羟基丁二酸，结构简式 HOOCCH(OH)CH(OH)COOH。酒石酸氢钾存在于葡萄汁内，此盐难溶于水和乙醇，在葡萄汁酿酒过程中沉淀析出，称为酒石，酒石酸的名称由此而来。有二个不对称的碳原子，有 3 种立体异构体，即：右旋型（D 型，L 型）、左旋型（L 型，D 型）、内消旋型。通常，外消旋型酒石酸又称为葡萄酸。右旋型酒石酸以游离的或 K 盐、Ca 盐、Mg 盐的形态广泛分布于高等植物中，特别是多存在于果实和叶中。在制造葡萄酒时，会沉积大量酒石（氢钾盐）
2、。另外，在霉菌和地衣类中也常见到它的存在。分离到的酒石酸发酵细菌（Gluconoba-cter suboxydans 的变异菌株），在体内是通过葡萄糖氧化分解，经由 5-酮葡萄糖酸，在形成羟基乙酸的同时形成酒石酸。酒石酸铵受微生物作用，可变成琥珀酸。因此，工业上用酒石酸作为生产琥珀酸的原料。酒石酸主要以钾盐的形式存在于多种植物和果实中，也有少量是以游离态存在的。用作抗氧化增效剂、制螯合剂、药剂。广泛用于医药、食品、制革、纺织等工业。测定水果中有机酸的方法目前有液相色谱分析法、气相色谱分析法、毛细管电泳法、滴定法等多种方法，但我们通常采用高效液相色谱分析技术。测定苹果中酒石酸的成分含量，采用高效
3、液相色谱法，固定相为 Phencmenex luna 5mC18色谱柱（250），流动相为（NH4)2HPO4溶液，流速为，进样量为20L，检测波长为 210nm，本法简便快速，灵活度和精密度高，准确可靠，可适用于水果中有机酸的测定。2.1 试剂及仪器 试剂：80%乙醇（500mL,天津市百花化工有限公司）、酒石酸（500g,重庆东方红试剂厂）、磷酸二氢铵（500g,西安化学试剂厂）均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。仪器：高效液相色谱仪Phencmenex luna 5mC18色谱柱（250）（U-3000，戴安中国有限公司)、离心机（上海安亭科学仪器厂）、超声机（KS-250D，宁波科生仪
4、器厂）、抽滤泵(天津奥特塞恩斯有限公司)、滤膜（m）、容量品、锥形瓶（50mL)、量筒（100mL）、玛瑙研钵、电子天平（BS110S，北京赛多利斯天平有限公司）、HH-Z电热恒温水浴锅、电炉子、蒸发皿、烧杯。2.2 实验原理 采用高效液相色谱法分析测定苹果中酒石酸的含量以及与标准酒石酸的分析对比，高效液相色谱分析法是主要具有高压，高速，高效，高灵敏度等特点，对试样进行分析测定。流动相和固定相都是液体，流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式：smkmsVVCCK 高效液相色谱计
5、算公式 式中，Cs溶质在固定相中浓度；Cm溶质在流动相中的浓度；Vs固定相的体积；Vm流动相的体积。LLPC 与 GPC 有相似之处，即分离的顺序取决于 K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC 中，流动相对 K 影响不大，LLPC 流动相对 K 影响较大。A正相液液分配色谱法 流动相的极性小于固定液的极性。B反相液液分配色谱法 流动相的极性大于固定液的极性。C液液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但是固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，造成固定液流失10。2.3 色谱条件 固定相为Phencmenex luna 5mC18色谱柱（250）
6、，流动相为（NH4)2HPO4溶液，流速1mLmin-1，检测波长为210nm，柱温为30。2.4 实验方法 2.4.1 标准溶液的配制 精确称取酒石酸标准品，置于烧杯中用二次蒸馏水完全溶解，转移至100mL容量瓶中加二次蒸馏水稀释并定容，然后用移液管移取分别稀释成gmL-1、gmL-1、gmL-1、gmL-1、gmL-1等不同质量浓度的标准品，并用m的滤膜过滤，然后超声处理。2.4.3 流动相的配制 采用电子天平准确称取(NH4)2HPO4晶体，于小烧杯中加入少量二次蒸馏水完全溶解，然后转移到 1000mL 容量瓶中并定容至刻度线，最后经 m 的滤膜过滤，超声 15min 处理作为流动相。3
7、 结果与讨论 3.1 标准品的进样分析 按上述色谱条件，待基线稳定后,用移液管准确移取不同质量浓度的样品分别置于进样瓶中，放入高效液相色谱仪进样盘中，洗针并进样，依次对不同质量浓度的标准品进行测定。酒石酸标准品色谱见图1：图1 标准品中酒石酸的色谱图 条件：流动相为(NH4)2HPO4溶液，流速1mLmin-1，检测波长为210nm，柱温为30，酒石酸标准品的质量浓度为gmL-1.3.2 样品的进样分析 按上述色谱条件，待基线稳定后，用移液管移取酒石酸的样品置于进样瓶中，放入高效液相色谱仪进样盘中，洗针并进样，酒石酸样品色谱见图2：图2 样品中酒石酸的色谱图 条件：流动相为(NH4)2HPO4
8、溶液，流速1mLmin-1，检测波长为210nm，柱温为30 3.3 工作曲线的绘制 图3 酒石酸的质量浓度和峰面积的线性关系 将质量浓度为gmL-1、gmL-1、gmL-1、gmL-1、gmL-1的酒石酸标准品，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积Y为纵坐标，标准溶液的质量浓度X为横坐标，回归方程为Y=+，相关系数r=0.98632。说明酒石酸在gmL-1范围内，峰面积与样品浓度之间呈良好线性关系，绘制标准曲线，其结果如上图3所示.4 结论 本方法以乙醇（80%）做溶剂对苹果中的酒石酸进行萃取，用高效液相色谱法进行测定，能准确的对苹果中的酒石酸进行定性和定量分析，研究结果得出酒石酸的含量是%，且检测线性范围较宽，具有操作简便，快速，选择性好等优点。