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1、基基 因因 操操 作作 原原 理理Principles of Gene Manipulation 一、什么是基因操作一、什么是基因操作 核心部分为cloning大多数西方国家对此都有一个精确的法律定义，(由于政府的法律约束),在英国将基因操作定义为“Principles of Gene Manipulation”,Black well Scientific Publications,RW.OLD&SB Primrose,1985.将在细胞外产生的核酸分子将在细胞外产生的核酸分子插入病毒插入病毒,质粒或其它载体系统中质粒或其它载体系统中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中再整合到那些本来不含该类
2、物质的宿主中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体从而形成一种新的可连续繁殖的有机体强调外源核酸分子(一般为DNA)在不同宿主中的繁殖打破自然种的界限将来自不相关物种的基因放入一个宿主中基因操作的重要特征 另一个特征是繁殖概念的延伸概念的延伸:个体内部基因的增加或减少个体内部基因的增加或减少这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达，调控，检测等，与基因研究相关的内容。了解对基因的研究是如何实施的二、本课程在学科发展中的地位二、本课程在学科发展中的地位这门课以前叫“分子克隆I”实验课为“分子克隆II”利用分子生物学原理利用分子生物学原理,为在分子或基因水为在分子或基
3、因水平的研究服务的学科平的研究服务的学科20世纪是生物学发展最为迅速的时期，世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于年由于认识了认识了DNA的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。研究的热潮。在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平同时由于遗传学的兴起与发展，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA作为生命遗传作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。的诞生。分子
4、生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行阐述的生物学，研究生物的生物学现象和本质，进行阐述的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如如DNA的结构复制、表达、调控、遗传、变异等。的结构复制、表达、调控、遗传、变异等。由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平学科都延伸到了分子水平在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，小的可以说某些物种的分子生
5、物学，如水稻的分子小的可以说某些物种的分子生物学，如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。物学。从学科发展的角度来看，传统的分子生物学就好象是高级从学科发展的角度来看，传统的分子生物学就好象是高级生物化学，阐述基因或者说生物化学，阐述基因或者说DNA（核酸）的静态和动态化（核酸）的静态和动态化学本质。学本质。目前的分子生物学正朝着发育、结构和遗传生物学的方向目前的分子生物学正朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展，为深层次阐明生命的现象和本质服务。发展，为深层次阐明生命的现象和本质服务。如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，
6、那么这如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，那么这些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡、以及遗传和变异的内在规律。研究生物的生长、分化、死亡、以及遗传和变异的内在规律。生物科学生物科学 领域领域医学生物 农业生物基础生物学目的目的要求掌握要求掌握基因操作中基本的普遍应用的原理基因操作中基本的普遍应用的原理并能自主设计通用操作方法和策略并能自主设计通用操作方法和策略对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内不设计具体的材料要求要求生物学生物学生物化学生物化学/遗传学遗传学分子生物学分子生物学
7、参考书籍参考书籍.Molecular Cloning V2.0,1989 分子克隆实验指南分子克隆实验指南 Edition 3,2001.2.基因工程原理第二版基因工程原理第二版吴乃虎科学出版社吴乃虎科学出版社1998/20003.分子生物学试剂产品目录分子生物学试剂产品目录New England BioLabs 参考书籍参考书籍其它基因及其操作原理其它基因及其操作原理精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南Internet Principles of Gene Manipulation(6th ed)Black well Scientific Publications S Primros
8、e,R Twyman,B OLD,2001.二、基因的基本概念二、基因的基本概念 基因是遗传信息的基本单位 从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子基因是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）基因及其产物的共线性基因及其产物的共线性基因及其产物的基因及其产物的非非共线性共线性基因的重叠与可变性基因的重叠与可变性一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应interrupted gene,intron三、基因的基本结构组成三、基因的基本结构组成编码区编码区 ORF启动子启动子
9、promoter RBS ribosomal binding site 终止区终止区 terminatorflanking sequence upstream/downstreamCap/tail 三、基因克隆的通用策略三、基因克隆的通用策略酶切酶切酶切酶切连接连接转化转化筛选筛选.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线酶切酶切酶切酶切连接连接.GAATT
10、C.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线酶切酶切酶切酶切连接连接.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线酶切酶切酶切酶切连接连接转化转化.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线酶切酶切酶切酶切连接连接转化转化筛选筛选.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI基因克隆的技术路线 5亚克隆初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”