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1、第四章 生物氢气 随着能源危机、环境污染、温室效应等问题的加剧，随着能源危机、环境污染、温室效应等问题的加剧，各国政府对清洁、可再生能源的研究投入正在不断增加。各国政府对清洁、可再生能源的研究投入正在不断增加。氢气因其相对密度低，燃烧热值高，在转化为热能或电能氢气因其相对密度低，燃烧热值高，在转化为热能或电能时只产生水蒸气，不会产生有毒气体和温室气体，是最清时只产生水蒸气，不会产生有毒气体和温室气体，是最清洁的环保能源，特别适用于交通运输，同时也是航天航空洁的环保能源，特别适用于交通运输，同时也是航天航空的理想燃料。因此，在的理想燃料。因此，在21世纪氢能经济所描绘的蓝图中，世纪氢能经济所描绘
2、的蓝图中，氢气是未来最理想的终端能源载体，它的实现将会为人类氢气是未来最理想的终端能源载体，它的实现将会为人类文明带来新的变革。文明带来新的变革。4.1.1 4.1.1 氢气的性质氢气的性质4.1 4.1 氢气的燃料特性氢气的燃料特性 在各种气体中（包括空气等混合气体），氢气的相对密在各种气体中（包括空气等混合气体），氢气的相对密度最小。标准状况下（常压与度最小。标准状况下（常压与0时），时），H2以无色、无味无以无色、无味无臭的气体存在，臭的气体存在，1L氢气的质量是氢气的质量是0.0899g；在常压下，温；在常压下，温度为度为-252.87时，氢气可转变成无色的液体；温度为时，氢气可转变成
3、无色的液体；温度为-259.1时，变成雪状固体。时，变成雪状固体。由于氢键键能大，燃烧由于氢键键能大，燃烧1g氢能释放出氢能释放出142kJ的热能，是的热能，是汽油发热量的汽油发热量的3倍。与汽油、天然气、煤油相比，氢的质量倍。与汽油、天然气、煤油相比，氢的质量特别轻，携带、运送方便，因而是航天、航空等高速飞行特别轻，携带、运送方便，因而是航天、航空等高速飞行交通工具最合适的燃料。交通工具最合适的燃料。氢与氧气反应的火焰温度可高达氢与氧气反应的火焰温度可高达2500，因此也常是切，因此也常是切割或者焊接钢铁材料的最佳燃料。割或者焊接钢铁材料的最佳燃料。氢气可以被金属氢化物、碳基吸附剂以及金属氢
4、气可以被金属氢化物、碳基吸附剂以及金属-有机配位有机配位子结构等多孔性且具有非常大表面积的材料大量吸附。当子结构等多孔性且具有非常大表面积的材料大量吸附。当外界加热或加压时，吸附于这些材料中的氢气释放出来，外界加热或加压时，吸附于这些材料中的氢气释放出来，这是目前开发新型氢气储运方法的理论基础。这是目前开发新型氢气储运方法的理论基础。4.1.2 4.1.2 氢的特性氢的特性 在大自然中，氢主要以化合态的形式存在于水、石油、煤在大自然中，氢主要以化合态的形式存在于水、石油、煤炭、天然气、各种生命有机体及其有机产物中。炭、天然气、各种生命有机体及其有机产物中。地球表面约地球表面约71%为水所覆盖，
5、储水量很大，其中海洋的总为水所覆盖，储水量很大，其中海洋的总体积约为体积约为13.7亿亿km3，因此，水是氢的大，因此，水是氢的大“仓库仓库”，以原子百，以原子百分比表示，水中含有分比表示，水中含有11%的氢。的氢。生物体及其所产生的各种有机物中也含有大量的氢，而地球生物体及其所产生的各种有机物中也含有大量的氢，而地球上有机物归根结底来源于光合作用，其中蕴藏的氢来源于水。上有机物归根结底来源于光合作用，其中蕴藏的氢来源于水。由于氢气燃烧后仍然形成水，所以，水和有机物是氢气由于氢气燃烧后仍然形成水，所以，水和有机物是氢气“取之不尽、用之不竭取之不尽、用之不竭”的源泉，的源泉，关键是用什么样的方法
6、从水中关键是用什么样的方法从水中或来源于光合作用的各种有机物中制取氢气。或来源于光合作用的各种有机物中制取氢气。生物制氢技术可以在常温、常压、能耗低、环境友好的生物制氢技术可以在常温、常压、能耗低、环境友好的条件下，从水或各种有机物中制取氢气，这一技术将有望条件下，从水或各种有机物中制取氢气，这一技术将有望取代目前主要来源于钢铁厂、焦化厂、氯碱厂等的副产品取代目前主要来源于钢铁厂、焦化厂、氯碱厂等的副产品回收纯化及煤、烃类、天然气和生物质的水蒸气重整技术。回收纯化及煤、烃类、天然气和生物质的水蒸气重整技术。正因为如此，对生物制氢技术的研究正在受到人们普遍正因为如此，对生物制氢技术的研究正在受到
7、人们普遍关注。关注。2005年以来，有关生物制氢方面的论文数量和专利年以来，有关生物制氢方面的论文数量和专利数量在急剧增加，这说明了生物制氢技术的研究步伐正在数量在急剧增加，这说明了生物制氢技术的研究步伐正在大大加快。大大加快。4.2 4.2 生物制氢原理生物制氢原理 自自Nakamura于于1937年首次发现微生物的产氢现象，到年首次发现微生物的产氢现象，到目前为止已报道有目前为止已报道有20多个属的细菌种类及真核生物绿藻具多个属的细菌种类及真核生物绿藻具有产氢能力。其中，有产氢能力。其中，产氢细菌分属兼性厌氧或厌氧发酵细产氢细菌分属兼性厌氧或厌氧发酵细菌、光合细菌、固氮菌和蓝细菌四大类。菌
8、、光合细菌、固氮菌和蓝细菌四大类。依据产氢能力，目前备受关注的微生物产氢代谢途径主依据产氢能力，目前备受关注的微生物产氢代谢途径主要有三种：要有三种：以厌氧或兼性厌氧微生物为主体的暗发酵产氢，它以各以厌氧或兼性厌氧微生物为主体的暗发酵产氢，它以各种废弃生物质为原料、工艺条件要求简单、产氢速度最快，种废弃生物质为原料、工艺条件要求简单、产氢速度最快，因此，暗发酵产氢技术的研究进展最快，离规模化生产的因此，暗发酵产氢技术的研究进展最快，离规模化生产的距离最近；距离最近；以紫色光合细菌为主体的光发酵产氢，是暗发酵产氢的以紫色光合细菌为主体的光发酵产氢，是暗发酵产氢的最佳补充，既能在暗发酵产氢的基础上
9、，进一步提高底物最佳补充，既能在暗发酵产氢的基础上，进一步提高底物向氢气的转化效率，又能消除暗发酵产氢过程中积累的有向氢气的转化效率，又能消除暗发酵产氢过程中积累的有机酸对环境危害的隐患，暗、光发酵偶联制氢技术有望成机酸对环境危害的隐患，暗、光发酵偶联制氢技术有望成为由废弃物或废水制氢的清洁生产工艺；为由废弃物或废水制氢的清洁生产工艺；蓝细菌和绿藻进行裂解水制氢，尽管目前生物裂解水制蓝细菌和绿藻进行裂解水制氢，尽管目前生物裂解水制氢技术在效率上仍处于劣势，但其以水为制氢底物，在原氢技术在效率上仍处于劣势，但其以水为制氢底物，在原料上具有优势。料上具有优势。虽然，许多固氮菌也具有产氢能力，但是因
10、为这类微生虽然，许多固氮菌也具有产氢能力，但是因为这类微生物产氢时需要的物产氢时需要的ATP来源于氧化有机物，而这些微生物氧来源于氧化有机物，而这些微生物氧化有机物产生化有机物产生ATP的效率非常低，所以，相对于以上其他的效率非常低，所以，相对于以上其他产氢微生物，其产氢速率低，应用前景不是很好。产氢微生物，其产氢速率低，应用前景不是很好。4.2.1 4.2.1 生物制氢的微生物学生物制氢的微生物学依据产氢代谢途径及产氢机理不同，我们将分别介依据产氢代谢途径及产氢机理不同，我们将分别介绍光解水产氢的微藻和蓝细菌、光发酵产氢的紫色光合绍光解水产氢的微藻和蓝细菌、光发酵产氢的紫色光合细菌及暗发酵产
11、氢的厌氧或兼性厌氧微生物。细菌及暗发酵产氢的厌氧或兼性厌氧微生物。4.2.1.1 4.2.1.1 光解水产氢的微生物光解水产氢的微生物 近年，随着对绿藻光水解制氢技术研究的不断深入，近年，随着对绿藻光水解制氢技术研究的不断深入，发现了许多能够用于发现了许多能够用于生物制氢的绿藻生物制氢的绿藻，主要包括淡水微，主要包括淡水微藻和海水微藻。莱茵衣藻是一种研究生物制氢的模式微藻和海水微藻。莱茵衣藻是一种研究生物制氢的模式微藻，另外，斜生栅藻、海洋绿藻、亚心形扁藻和小球藻藻，另外，斜生栅藻、海洋绿藻、亚心形扁藻和小球藻等都具有产氢的能力。等都具有产氢的能力。能够产生氢气的蓝细菌有固氮菌鱼腥藻、海洋蓝细
12、菌能够产生氢气的蓝细菌有固氮菌鱼腥藻、海洋蓝细菌颤藻、丝状蓝藻等和非固氮菌如聚球藻、黏杆蓝细菌等。颤藻、丝状蓝藻等和非固氮菌如聚球藻、黏杆蓝细菌等。研究表明，研究表明，鱼腥藻属蓝细菌鱼腥藻属蓝细菌生成氢气的能力远远高于其生成氢气的能力远远高于其他蓝细菌属，其中，丝状异型胞蓝细菌和多变鱼腥蓝细他蓝细菌属，其中，丝状异型胞蓝细菌和多变鱼腥蓝细菌都具有强大的产氢能力，因而受到人们的广泛关注。菌都具有强大的产氢能力，因而受到人们的广泛关注。目前研究比较深入的放氢蓝细菌主要有鱼腥藻属，目前研究比较深入的放氢蓝细菌主要有鱼腥藻属，念念珠藻属的几种异型胞蓝细菌如丝状异型胞蓝细菌、多变珠藻属的几种异型胞蓝细菌
13、如丝状异型胞蓝细菌、多变鱼腥蓝细菌和念珠藻，个别胶州湾聚球菌属和集胞藻属鱼腥蓝细菌和念珠藻，个别胶州湾聚球菌属和集胞藻属的蓝细菌种类，它们的产氢速率为的蓝细菌种类，它们的产氢速率为0.174.2molH2/(mgchlah)。绿藻研究的种类也非常少绿藻研究的种类也非常少，最常见的，最常见的是莱茵衣藻，其最高速度低于是莱茵衣藻，其最高速度低于2mL/(L h)蓝细菌或绿藻都具有两个光合作用系统，其中，光合作用系蓝细菌或绿藻都具有两个光合作用系统，其中，光合作用系统统（PS）能吸收光能分解水，产生质子和电子，并同时产）能吸收光能分解水，产生质子和电子，并同时产生氧气。在厌氧条件下，所产生的电子会被
14、传递给铁氧还蛋白，生氧气。在厌氧条件下，所产生的电子会被传递给铁氧还蛋白，然后分别由固氮酶或氢酶将电子传递给质子进一步形成氢气。然后分别由固氮酶或氢酶将电子传递给质子进一步形成氢气。但产氢的过程同时也是产氧的过程，而氧气的存在会是固氮酶但产氢的过程同时也是产氧的过程，而氧气的存在会是固氮酶或氢酶的活性下降，所以或氢酶的活性下降，所以在一般培养条件下，蓝细菌或绿藻的在一般培养条件下，蓝细菌或绿藻的产氢效率非常低，甚至不能产氢。产氢效率非常低，甚至不能产氢。研究者们希望通过传统育种或基因工程的方法，来提高绿藻或研究者们希望通过传统育种或基因工程的方法，来提高绿藻或蓝细菌的光裂解水产氢效率。蓝细菌的
15、光裂解水产氢效率。4.2.1.2 4.2.1.2 暗发酵产氢的微生物暗发酵产氢的微生物 发酵产氢微生物可以在发酵过程中分解有机物产生氢发酵产氢微生物可以在发酵过程中分解有机物产生氢气、二氧化碳和各种有机酸。它包括梭菌科中的梭菌属，气、二氧化碳和各种有机酸。它包括梭菌科中的梭菌属，丁酸芽孢杆菌属，肠杆菌科的埃希氏菌属、肠杆菌属和丁酸芽孢杆菌属，肠杆菌科的埃希氏菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属，瘤胃球菌属，脱硫弧菌属，柠檬酸杆菌克雷伯氏菌属，瘤胃球菌属，脱硫弧菌属，柠檬酸杆菌属，醋微菌属，以及芽孢杆菌属和乳杆菌属的某些种。属，醋微菌属，以及芽孢杆菌属和乳杆菌属的某些种。其中，其中，研究比较多的是专性厌
16、氧的梭菌科和兼性厌氧的研究比较多的是专性厌氧的梭菌科和兼性厌氧的肠杆科的微生物。肠杆科的微生物。不同种类的微生物对同一有机底物的产氢能力不同，不同种类的微生物对同一有机底物的产氢能力不同，通常严格厌氧菌高于兼性厌氧菌。通常严格厌氧菌高于兼性厌氧菌。随着研究的广泛开展，不断有新的具有高效产氢能力随着研究的广泛开展，不断有新的具有高效产氢能力的菌株被分离。的菌株被分离。通过基因工程改造产氢微生物的代谢途径将有助于提通过基因工程改造产氢微生物的代谢途径将有助于提高它们的产氢能力。高它们的产氢能力。除了分离纯化出来的纯菌用于生物制氢，近几年来，除了分离纯化出来的纯菌用于生物制氢，近几年来，优化选育后的
17、混合菌群产氢更受关注。优化选育后的混合菌群产氢更受关注。4.2.1.3 4.2.1.3 光发酵产氢的微生物光发酵产氢的微生物 在光照条件下，紫色硫细菌（荚硫菌属和着色菌属）在光照条件下，紫色硫细菌（荚硫菌属和着色菌属）利用无机物利用无机物H2S，紫色非硫细菌（红螺菌属和红细菌属），紫色非硫细菌（红螺菌属和红细菌属）利用有机物（各种有机物）作为质子和电子供体产氢，利用有机物（各种有机物）作为质子和电子供体产氢，由于这类反应在厌氧条件下进行，类似于发酵过程，所由于这类反应在厌氧条件下进行，类似于发酵过程，所以这种产氢方式常被称为光发酵产氢。以这种产氢方式常被称为光发酵产氢。紫色硫细菌和紫色非硫细菌
18、具有紫色硫细菌和紫色非硫细菌具有PS,并由并由PS通过光合磷通过光合磷酸化提供给光发酵产氢的驱动力酸化提供给光发酵产氢的驱动力ATP，但这些微生物不具有，但这些微生物不具有PS，不能裂解水，所以不存在同时产氧气的现象。，不能裂解水，所以不存在同时产氧气的现象。目前常用来产氢的光合细菌种类主要有：深红红螺菌，沼目前常用来产氢的光合细菌种类主要有：深红红螺菌，沼泽红假单胞菌，类球红细菌，荚膜红细菌等。泽红假单胞菌，类球红细菌，荚膜红细菌等。由于光发酵产氢依赖于固氮酶催化，因此，铵抑制现象也由于光发酵产氢依赖于固氮酶催化，因此，铵抑制现象也是阻碍光发酵产氢技术应用的重要环节。是阻碍光发酵产氢技术应用
19、的重要环节。目前，科学家们更注重采用诱变、分子生物学和基因工程目前，科学家们更注重采用诱变、分子生物学和基因工程技术手段相结合的办法来选育产氢速率快、底物转化效率高、技术手段相结合的办法来选育产氢速率快、底物转化效率高、光能利用效率高、利用底物或者有机废弃物范围广、对铵离子光能利用效率高、利用底物或者有机废弃物范围广、对铵离子的耐受能力高的优良产氢菌株。的耐受能力高的优良产氢菌株。同样针对产氢光合细菌对光能的利用率比较低的现象，除同样针对产氢光合细菌对光能的利用率比较低的现象，除了对吸氢酶进行敲除外，对其捕光系统的改造也是一个趋势。了对吸氢酶进行敲除外，对其捕光系统的改造也是一个趋势。研究发现
20、能进行光发酵产氢的许多微生物在黑暗厌氧条件研究发现能进行光发酵产氢的许多微生物在黑暗厌氧条件下也能进行发酵产氢。下也能进行发酵产氢。4.2.2 4.2.2 生物制氢的关键性酶生物制氢的关键性酶 光解水、厌氧发酵及光发酵产氢过程光解水、厌氧发酵及光发酵产氢过程都涉及许多不同的代谢都涉及许多不同的代谢途径，许多酶参与这些产氢代谢的催化，其中，途径，许多酶参与这些产氢代谢的催化，其中，固氮酶和氢酶固氮酶和氢酶是生物制氢的两个最关键的酶。是生物制氢的两个最关键的酶。不同微生物类群或者利用氢酶不同微生物类群或者利用氢酶产氢、或者利用固氮酶产氢：同是光裂解水产氢，产氢、或者利用固氮酶产氢：同是光裂解水产氢
21、，微藻依靠氢微藻依靠氢酶产氢酶产氢，蓝细菌主要依靠固氮酶产氢蓝细菌主要依靠固氮酶产氢，黑暗厌氧发酵微生物依黑暗厌氧发酵微生物依赖氢酶产氢赖氢酶产氢，而光发酵细菌依赖固氮酶产氢而光发酵细菌依赖固氮酶产氢。固氮酶是一种多功能的氧化还原酶，主要成分是钼铁固氮酶是一种多功能的氧化还原酶，主要成分是钼铁蛋白和铁蛋白，存在于能够发生固氮作用的原核生物如固蛋白和铁蛋白，存在于能够发生固氮作用的原核生物如固氮菌和光合细菌（包括蓝细菌）中，该酶能够把空气中的氮菌和光合细菌（包括蓝细菌）中，该酶能够把空气中的N2转化生成转化生成NH3或氨基酸，反应式为：或氨基酸，反应式为：N2+8e-+8H+16ATP 2NH4
22、+16ADP+16Pi。固氮酶催化的还。固氮酶催化的还原反应至少需要原反应至少需要4个条件：钼铁蛋白、铁蛋白、个条件：钼铁蛋白、铁蛋白、ATP电子电子供体和厌氧条件。供体和厌氧条件。当反应系统无当反应系统无N2存在、还原底物只有存在、还原底物只有H+时，固氮酶将所有电子用于还原时，固氮酶将所有电子用于还原H+生成氢气，反应式为：生成氢气，反应式为：2e+2H+4ATP H2+4ADP+4Pi。4.2.2.1 4.2.2.1 固氮酶固氮酶 固氮酶还原分子氮为氨，也可以还原氮气以外的叁键固氮酶还原分子氮为氨，也可以还原氮气以外的叁键化合物，包括氰化物、乙炔及氮氧化物和质子。乙炔还原化合物，包括氰化
23、物、乙炔及氮氧化物和质子。乙炔还原为乙烯常被用来测定离体或整体的固氮酶活性。为乙烯常被用来测定离体或整体的固氮酶活性。质子还原质子还原的反应就是光合产氢的生物学依据的反应就是光合产氢的生物学依据。由于固氮反应需要消耗大量能量，固氮酶的合成和调由于固氮反应需要消耗大量能量，固氮酶的合成和调控受严格控制：控受严格控制：首先，固氮酶的活性对氧气非常敏感。首先，固氮酶的活性对氧气非常敏感。另外，固氮酶的合成和活性还受体内体外氮源的丰富另外，固氮酶的合成和活性还受体内体外氮源的丰富程度影响，当氮源充足时，固氮酶也是受抑制的，甚至基程度影响，当氮源充足时，固氮酶也是受抑制的，甚至基本不会表达，只有在氮饥饿
24、时固氮酶才会高效表达。本不会表达，只有在氮饥饿时固氮酶才会高效表达。最后，固氮酶本身的活性还受到翻译后修饰的调控。最后，固氮酶本身的活性还受到翻译后修饰的调控。4.2.2.2 4.2.2.2 氢酶氢酶 氢酶是另一种参与产氢代谢的关键性酶，它催化氢气氢酶是另一种参与产氢代谢的关键性酶，它催化氢气与质子相互转化的反应：与质子相互转化的反应：H2 2H+2e-。氢酶存在于原。氢酶存在于原核和真核生物中，按催化反应的结果可分为放氢酶和吸氢核和真核生物中，按催化反应的结果可分为放氢酶和吸氢酶两种。酶两种。氢酶是氢酶是Fe-S蛋白，在它们的活性中心一般有两个金属蛋白，在它们的活性中心一般有两个金属原子。根
25、据活性中心的金属组成类型可以分为三类：原子。根据活性中心的金属组成类型可以分为三类：活动中心由一个活动中心由一个Fe原子和一个原子和一个Ni原子组成的原子组成的NiFe 氢酶氢酶；由两个由两个Fe原子组成的原子组成的FeFe 氢酶氢酶；近年只在一些甲烷菌中发现的不含有近年只在一些甲烷菌中发现的不含有Fe-S簇和簇和Ni原子的原子的无无Fe-S簇氢酶或簇氢酶或Fe氢酶氢酶，它的功能是生成氢气的甲基四氢蝶，它的功能是生成氢气的甲基四氢蝶呤脱氢酶。呤脱氢酶。4.2.3 4.2.3 生物制氢的产氢机理生物制氢的产氢机理 蓝细菌和绿藻的产氢具有两个独立但协调起作用的光蓝细菌和绿藻的产氢具有两个独立但协调
26、起作用的光合作用中心，即接收太阳能分解水产生合作用中心，即接收太阳能分解水产生H+、电子和、电子和O2的光的光合系统合系统（PS）以及产生还原剂用来固定）以及产生还原剂用来固定CO2的光合系的光合系统统（PS）。）。PS产生的电子经由产生的电子经由PS再由铁氧还蛋白携带至氢再由铁氧还蛋白携带至氢酶（绿藻）或固氮酶（蓝细菌），在厌氧条件下，酶（绿藻）或固氮酶（蓝细菌），在厌氧条件下，H+在在氢酶或固氮酶的催化作用下形成氢酶或固氮酶的催化作用下形成H2，同时，电子也可能经，同时，电子也可能经由铁氧化还原蛋白传递至由铁氧化还原蛋白传递至NAD(P)+，形成，形成NAD(P)H用于固用于固定二氧化氮，
27、生成碳水化合物（图定二氧化氮，生成碳水化合物（图4.1）。）。4.2.3.1 4.2.3.1 蓝细菌和绿藻的光解水产氢机理蓝细菌和绿藻的光解水产氢机理H+H+低低高高CH2OATP合成酶合成酶H+ATPNAD(P)H+ATP+CO2PSe-FdFpNAD(P)HPCe-H+H+Cytb6fH+太阳光太阳光太阳光太阳光氢酶氢酶e-H+H2PSH2OH+O2e-H+QQH2图图4.1 微藻光解水产氢过程电子传递示意图微藻光解水产氢过程电子传递示意图 绿色植物由于没有氢酶或固氮酶，所以不能产生氢气，绿色植物由于没有氢酶或固氮酶，所以不能产生氢气，这是藻类和绿色植物光合作用过程的重要区别所在。因此除这
28、是藻类和绿色植物光合作用过程的重要区别所在。因此除氢气的形成外，绿藻的作用机理和绿色植物光合作用机理相氢气的形成外，绿藻的作用机理和绿色植物光合作用机理相似，绿色植物的光合作用规律和研究结论可以用于藻类新陈似，绿色植物的光合作用规律和研究结论可以用于藻类新陈代谢过程分析。代谢过程分析。蓝细菌和微藻均可光裂解水产生氢气，它们的产氢机制蓝细菌和微藻均可光裂解水产生氢气，它们的产氢机制也基本相似，需要强调的是，微藻在光照和厌氧条件下的产也基本相似，需要强调的是，微藻在光照和厌氧条件下的产氢由氢酶催化，但蓝细菌的产氢主要由固氮酶催化。微藻的氢由氢酶催化，但蓝细菌的产氢主要由固氮酶催化。微藻的氢酶属于氢
29、酶属于FeFeFeFe氢酶，为双向氢酶。氢酶，为双向氢酶。4.2.3.2 4.2.3.2 暗发酵产氢暗发酵产氢 产氢微生物能够根据自身的生理代谢特征，通过发酵作产氢微生物能够根据自身的生理代谢特征，通过发酵作用，在逐步分解有机底物的过程中产生分子氢。用，在逐步分解有机底物的过程中产生分子氢。目前发现细菌黑暗厌氧发酵的产氢途径主要分为三种：目前发现细菌黑暗厌氧发酵的产氢途径主要分为三种：丙酮酸脱氢途径丙酮酸脱氢途径 甲酸裂解途径甲酸裂解途径 NADH+HNADH+H+产氢途径产氢途径 梭状芽孢杆菌类专性厌氧微生物主要为丙酮酸脱氢发酵梭状芽孢杆菌类专性厌氧微生物主要为丙酮酸脱氢发酵型产氢细菌，直接
30、产氢过程发生于丙酮酸脱羧作用中，丙酮型产氢细菌，直接产氢过程发生于丙酮酸脱羧作用中，丙酮酸首先在丙酮酸脱氢酶的作用下脱羧，形成硫胺素焦磷酸酸首先在丙酮酸脱氢酶的作用下脱羧，形成硫胺素焦磷酸-酶酶的复合物，将电子转移给铁氧还蛋白，形成还原态的铁氧还的复合物，将电子转移给铁氧还蛋白，形成还原态的铁氧还蛋白（蛋白（FdFdredred）,然后在氢酶的作用下被重新氧化成氧化态的铁然后在氢酶的作用下被重新氧化成氧化态的铁氧还蛋白（氧还蛋白（FdFdoxox）,并产生分子氢；并产生分子氢；肠杆菌类兼性厌氧微生物属于甲酸裂解型发酵产氢菌，肠杆菌类兼性厌氧微生物属于甲酸裂解型发酵产氢菌，直接产氢过程也发生于丙
31、酮酸脱梭过程中，丙酮酸脱羧后形直接产氢过程也发生于丙酮酸脱梭过程中，丙酮酸脱羧后形成的甲酸（也包括厌氧环境中成的甲酸（也包括厌氧环境中COCO2 2和和H H2 2生成的甲酸），通过铁生成的甲酸），通过铁氧还蛋白和氢酶作用分解为氧还蛋白和氢酶作用分解为COCO2 2和和H H2 2。NADH+HNADH+H+产氢途径的产氢能力取决于产氢途径的产氢能力取决于NADH+HNADH+H+的剩余量和转的剩余量和转化率。化率。CH3COCOOH丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶CO2CH3CTPPEOHHSCoATPP-ECH3COSCoA2Fe3+2Fe2+8FeFd2H+H2ACH3COCOOHHCOOHHS
32、CoA丙酮酸甲酸裂解酶丙酮酸甲酸裂解酶CH3COSCoACO22Fe2+2Fe3+FdH22H+图图4.2 暗发酵产氢途径暗发酵产氢途径BA.梭杆菌属的丙酮酸脱氢途径；梭杆菌属的丙酮酸脱氢途径；B.肠杆菌的甲酸裂解途径肠杆菌的甲酸裂解途径 在暗发酵产氢中，通常是将复杂的糖类水解后生成单糖，在暗发酵产氢中，通常是将复杂的糖类水解后生成单糖，单糖通过丙酮酸途径实现分解，产生氢气的同时伴随着一些低单糖通过丙酮酸途径实现分解，产生氢气的同时伴随着一些低分子有机酸和醇类产生。也正是因为大量的有机酸或醇类产生，分子有机酸和醇类产生。也正是因为大量的有机酸或醇类产生，使得单糖转化成氢气的理论值也较低。使得单
33、糖转化成氢气的理论值也较低。微生物的糖降解经过丙酮酸主要有微生物的糖降解经过丙酮酸主要有EMPEMP途径、途径、HMPHMP途径、途径、EDED途径、途径、PKPK途径。丙酮酸经发酵后转化为乙酸、丙酸、丁酸、乙途径。丙酮酸经发酵后转化为乙酸、丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等。醇和乳酸等。根据丙酮酸的不同去路，可以将各种发酵产氢途径分为丁根据丙酮酸的不同去路，可以将各种发酵产氢途径分为丁酸型发酵、乙酸型发酵、丁醇型发酵、混合型发酵产氢途径。酸型发酵、乙酸型发酵、丁醇型发酵、混合型发酵产氢途径。其中，梭状芽孢杆菌属主要为丁酸型发酵产氢途径；肠杆其中，梭状芽孢杆菌属主要为丁酸型发酵产氢途径；肠杆菌主要为混合
34、型发酵产氢途径；丙酮菌主要为混合型发酵产氢途径；丙酮-丁醇梭菌和拜氏梭菌主丁醇梭菌和拜氏梭菌主要为丁醇型发酵产氢途径；梭菌属中部分细菌、瘤胃球菌属、要为丁醇型发酵产氢途径；梭菌属中部分细菌、瘤胃球菌属、拟杆菌属等主要为乙醇型发酵产氢途径。可溶性糖类，如葡拟杆菌属等主要为乙醇型发酵产氢途径。可溶性糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等的发酵以丁酸型发酵为主，这是萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等的发酵以丁酸型发酵为主，这是一种经典的发酵产氢方式，发酵产生的末端产物主要为丁酸、一种经典的发酵产氢方式，发酵产生的末端产物主要为丁酸、乙酸、乙酸、H H2 2、COCO2 2和少量的丙酸，如图和少量的丙酸，如图4.3
35、4.3所示。所示。一些糖类在发酵过程中，经一些糖类在发酵过程中，经EMPEMP途径产生的途径产生的NADH+H+通通过与一定比例的丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等发酵过程相偶联过与一定比例的丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等发酵过程相偶联而氧化为而氧化为NAD+，来保证代谢过程中的，来保证代谢过程中的NADH/NAD+的平衡。的平衡。为了避免为了避免NADH+H+的积累从而保证代谢的正常进行，发酵细的积累从而保证代谢的正常进行，发酵细菌可以通过释放菌可以通过释放H2的方式将过量的的方式将过量的NADH+H+氧化，反应式氧化，反应式为：为：NADH+H+NAD+H2，此反应是在，此反应是在NADH铁氧铁氧还蛋白氧
36、化还原酶、铁氧还蛋白氢化酶作用下完成，其末端还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白氢化酶作用下完成，其末端产物主要是丙酸和乙酸，气体产物非常少，一些学者把这种产物主要是丙酸和乙酸，气体产物非常少，一些学者把这种制氢称作为丙酸型发酵制氢。制氢称作为丙酸型发酵制氢。葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸NADHNAD乙酰乙酰CoA丁缩醛丁缩醛CoAFdoxFdredNADHNADH2HSCoACO2乙酰磷酸乙酰磷酸乙酸乙酸丁酸丁酸图图4.3 4.3 丁酸型发酵途径丁酸型发酵途径 乙醇型产氢途径与传统的乙醇发酵不同，传统的乙醇发酵乙醇型产氢途径与传统的乙醇发酵不同，传统的乙醇发酵没有氢气产生，而乙醇型产氢途径产生乙醇和乙酸
37、的同时有氢没有氢气产生，而乙醇型产氢途径产生乙醇和乙酸的同时有氢气产生，主要末端发酵产物为乙醇、乙酸、气产生，主要末端发酵产物为乙醇、乙酸、H H2 2、COCO2 2和少量丁酸，和少量丁酸，如图如图4.44.4所示。所示。乙醇乙醇葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸NADHNAD乙酰乙酰CoA乙醛乙醛FdoxFdredNADHNADH2HSCoACO2HSCoANADHNAD图图4.4 乙醇型发酵途径乙醇型发酵途径4.2.3.3 4.2.3.3 光合细菌制氢光合细菌制氢 在产氢光合细菌中，外源性有机物，特别是各种有机酸在产氢光合细菌中，外源性有机物，特别是各种有机酸作为电子供体，通过作为电子供体，通过E
38、MPEMP和和TCATCA循环生成腺嘌呤核苷三磷酸循环生成腺嘌呤核苷三磷酸（ATPATP）、）、COCO2 2以及电子，这些电子通过胞内的电子传递链传以及电子，这些电子通过胞内的电子传递链传至光反应中心，低能态的电子在光反应中心受到光的激发，至光反应中心，低能态的电子在光反应中心受到光的激发，生成高能态的电子。高能态的电子一部分离开电子传递链被生成高能态的电子。高能态的电子一部分离开电子传递链被传递给铁氧还蛋白，铁氧还蛋白则又将电子传给固氮酶；另传递给铁氧还蛋白，铁氧还蛋白则又将电子传给固氮酶；另一部分的电子则在电子传递中传递，通过光合磷酸化途径并一部分的电子则在电子传递中传递，通过光合磷酸化
39、途径并生成生成ATPATP。在光照条件下，固氮酶利用。在光照条件下，固氮酶利用ATPATP、质子和电子生产、质子和电子生产氢气，氢酶主要起吸氢作用，以回收部分能量。光合细菌产氢气，氢酶主要起吸氢作用，以回收部分能量。光合细菌产氢的机理和途径见图氢的机理和途径见图4.5.4.5.光收集系统光收集系统和光反应中心和光反应中心铁醌铁醌泛琨泛琨e-e-铁氧化蛋白铁氧化蛋白铁还原蛋白铁还原蛋白细胞色素细胞色素c细胞色素细胞色素be-e-e-ATPADP+Pi碳源代谢系统碳源代谢系统（EMP，TCA等）等）底物底物电子供体电子供体e-H+CO2ATPADP+Pi固氮酶固氮酶氢酶氢酶H2e-图图4.5 4.
40、5 光合细菌产氢的机理和途径光合细菌产氢的机理和途径 光合细菌所固有的只有一个光合作用中心的特殊简单结光合细菌所固有的只有一个光合作用中心的特殊简单结构，决定了它所固有的相对较高的光转化效率，以及提高光构，决定了它所固有的相对较高的光转化效率，以及提高光转化效率的巨大潜力。转化效率的巨大潜力。由于固氮酶的表达及活性受铵抑制调控，因此，光发酵由于固氮酶的表达及活性受铵抑制调控，因此，光发酵产氢也同样受铵离子浓度的影响。在光发酵产氢的过程中同产氢也同样受铵离子浓度的影响。在光发酵产氢的过程中同时伴随着吸氢现象，在发酵过程中，吸氢活性增加，固氮酶时伴随着吸氢现象，在发酵过程中，吸氢活性增加，固氮酶活
41、性较弱，产氢量减少。活性较弱，产氢量减少。对各类微生物的产氢机理的解析，将对优化生物产氢工艺条件，包括光能、温度、pH、气相组成和培养基营养组成等具有很好的指导作用，也将为通过代谢工程提高微生物的产氢效率奠定基础。蓝细菌和微藻的光解水产氢以水作为唯一的质子与电子的蓝细菌和微藻的光解水产氢以水作为唯一的质子与电子的供体。尽管与其他生物产氢途径相比，目前生物裂解水制氢技供体。尽管与其他生物产氢途径相比，目前生物裂解水制氢技术在效率上仍处于劣势，但其以水为制氢底物，在原料成本上术在效率上仍处于劣势，但其以水为制氢底物，在原料成本上具有优势，因此，光解水产氢技术一直是人类希望实现的目标。具有优势，因此
42、，光解水产氢技术一直是人类希望实现的目标。厌氧发酵产氢与光合细菌发酵产氢都需要有机物作为产氢厌氧发酵产氢与光合细菌发酵产氢都需要有机物作为产氢原料。许多暗发酵产氢微生物都能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、原料。许多暗发酵产氢微生物都能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉产氢，有的暗发酵微生物还能利用五碳糖、木聚糖产氢，淀粉产氢，有的暗发酵微生物还能利用五碳糖、木聚糖产氢，还有些微生物能利用纤维素产氢。还有些微生物能利用纤维素产氢。研究表明不同微生物利用同研究表明不同微生物利用同一种原料，或者同一种微生物利用不同的原料，其产氢效率或一种原料，或者同一种微生物利用不同的原料，其产氢效率或产氢速度也会有差异。产氢速
43、度也会有差异。一些厌氧发酵微生物也可以利用纤维素类物质产氢。一些厌氧发酵微生物也可以利用纤维素类物质产氢。4.3 4.3 生物制氢原料生物制氢原料 虽然许多光合细菌也能利用单糖产氢进行还有些微生物能虽然许多光合细菌也能利用单糖产氢进行还有些微生物能利用纤维素产氢。利用纤维素产氢。研究表明不同微生物利用同一种原料，或者研究表明不同微生物利用同一种原料，或者同一种微生物利用不同的原料，其产氢效率或产氢速度也会有同一种微生物利用不同的原料，其产氢效率或产氢速度也会有差异。差异。一些厌氧发酵微生物也可以利用纤维素类物质产氢。一些厌氧发酵微生物也可以利用纤维素类物质产氢。虽然许多光合细菌也能利用单糖产氢
44、进行光发酵产氢，有虽然许多光合细菌也能利用单糖产氢进行光发酵产氢，有的还可以利用蔗糖、果糖产氢，但利用糖类的产氢效率一般低的还可以利用蔗糖、果糖产氢，但利用糖类的产氢效率一般低于以有机酸为底物的产氢效率。所以，各种有机酸，特别是三于以有机酸为底物的产氢效率。所以，各种有机酸，特别是三羧酸循环中的各种有机酸，是大多数光合细菌进行光发酵产氢羧酸循环中的各种有机酸，是大多数光合细菌进行光发酵产氢的最佳原料。但许多微生物只能利用上面所描述底物中的一部的最佳原料。但许多微生物只能利用上面所描述底物中的一部分进行产氢，分进行产氢，所以，通过驯化或选育来增加产氢微生物的底物所以，通过驯化或选育来增加产氢微生
45、物的底物范围，也是目前生物产氢技术研究中的方向之一。范围，也是目前生物产氢技术研究中的方向之一。为了降低制氢成本，也为了生物制氢技术同时能治理环境，为了降低制氢成本，也为了生物制氢技术同时能治理环境，近年来许多研究者都在尝试利用各种废弃生物质，包括农业废近年来许多研究者都在尝试利用各种废弃生物质，包括农业废弃物、生活垃圾或者有机废水进行生物产氢。已经尝试过用于弃物、生活垃圾或者有机废水进行生物产氢。已经尝试过用于厌氧暗发酵生物制氢的废弃原料有：各种作物秸秆（纤维素）、厌氧暗发酵生物制氢的废弃原料有：各种作物秸秆（纤维素）、食品加工废水、橄榄油加工废水、牛奶加工废水、酿酒废水、食品加工废水、橄榄
46、油加工废水、牛奶加工废水、酿酒废水、柠檬酸生产废水、糖蜜废水、橱余垃圾以及城市固体废弃物或柠檬酸生产废水、糖蜜废水、橱余垃圾以及城市固体废弃物或者污泥处理厂的污泥等。者污泥处理厂的污泥等。光合细菌的光发酵产氢底物也可以来源于各种废水。如果光合细菌的光发酵产氢底物也可以来源于各种废水。如果将光发酵产氢与暗发酵产氢进行偶联，那么可以更有效地利用将光发酵产氢与暗发酵产氢进行偶联，那么可以更有效地利用各种组成复杂的有机废水产氢。各种组成复杂的有机废水产氢。由此可见，光合细菌既可以将由此可见，光合细菌既可以将工业有机酸废水和工业发酵废水直接转化为清洁能源，同时又工业有机酸废水和工业发酵废水直接转化为清洁
47、能源，同时又可以降低废水中可以降低废水中CODCOD，具有减少环境污染和产生氢能的双重作，具有减少环境污染和产生氢能的双重作用，这将是很有前景的研究方向。用，这将是很有前景的研究方向。4.4 4.4 生物制氢工艺（自学）生物制氢工艺（自学）4.5 4.5 生物制氢实践生物制氢实践 目前有关生物制氢技术的研究多处于实验室研究阶段，而目前有关生物制氢技术的研究多处于实验室研究阶段，而且，目前生物制氢的产氢成本尚无法与工业废气回收制氢竞争。且，目前生物制氢的产氢成本尚无法与工业废气回收制氢竞争。利用暗发酵速度较快，产量较多，能广泛利用废弃生物质和工利用暗发酵速度较快，产量较多，能广泛利用废弃生物质和
48、工业有机废水发酵产氢。业有机废水发酵产氢。如如“生物制氢生物制氢-产甲烷发酵产甲烷发酵-交叉流好氧交叉流好氧”为主体的高浓度有机废水生物制氢和废水处理综合工艺系统。为主体的高浓度有机废水生物制氢和废水处理综合工艺系统。预处理废弃物预处理废弃物暗发酵暗发酵气体分离气体分离氢气氢气二氧化碳二氧化碳暗发酵液暗发酵液再次发酵再次发酵再次产氢再次产氢或产甲烷或产甲烷图图4.4.生物产氢中试主要工业流程生物产氢中试主要工业流程 生物制氢将废弃物资源化、能源化和环保化融为一体，具生物制氢将废弃物资源化、能源化和环保化融为一体，具有环节国家能源紧张同时减少环境污染的双重作用，是非常有有环节国家能源紧张同时减少
49、环境污染的双重作用，是非常有发展前途的生物技术。但是，生物制氢技术从实验室研究走向发展前途的生物技术。但是，生物制氢技术从实验室研究走向大规模应用还有许多基础理论问题和工程技术问题需要解决。大规模应用还有许多基础理论问题和工程技术问题需要解决。今后的研究重点应主要集中在：今后的研究重点应主要集中在：继续筛选自然界中具有高效发酵产氢活性的微生物；继续筛选自然界中具有高效发酵产氢活性的微生物；寻找最佳的产氢条件，提高固氮酶、双向氢酶和其他负责寻找最佳的产氢条件，提高固氮酶、双向氢酶和其他负责调控产氢效率的重要功能酶的催化活性及抗逆性；调控产氢效率的重要功能酶的催化活性及抗逆性；利用定点突变、基因敲除、代谢途径的改变等分子生物学利用定点突变、基因敲除、代谢途径的改变等分子生物学和遗传学技术手段，得到高效率产氢的工程菌株。和遗传学技术手段，得到高效率产氢的工程菌株。作业：作业：1.1.简述微生物制氢种类、途径。简述微生物制氢种类、途径。2.2.微生物制氢关键酶有哪些？微生物制氢关键酶有哪些？