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1、蛋白质结构一级结构、二级结构、三级结构和四级结构一级结构、二级结构、三级结构和四级结构多肽链氨基酸顺序分析多肽链氨基酸顺序分析蛋白质的结构蛋白质的结构 蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合而成。当多肽的分子量大到足够方式组合而成。当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质。具有一定的空间结构时就称为蛋白质。蛋白质与多肽的主要蛋白质与多肽的主要差别：差别：分子量，空间结构分子量，空间结构 蛋白质结构蛋白质结构一级结构一级结构三维结构三维结构蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（primarystructure）1定义：定义：蛋白质的一级结构包括组成蛋
2、白质的蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目多肽链数目、多肽链的多肽链的氨基酸顺序氨基酸顺序，以及多肽链内或链间，以及多肽链内或链间二硫键二硫键的的数数目和位置目和位置。其中最重要的是其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质它是蛋白质生物功能的基础。生物功能的基础。蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅影响蛋白质的高级蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅影响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其结构，而且将直接影响其生理功能生理功能。蛋白质一级结构蛋白质一级结构氨基酸顺序氨基酸顺序镰形细胞贫血的遗传性镰形细胞贫血的遗传性疾病，特征是病者的血红蛋疾病，特征是病者的血红蛋白发生变异。白发生变
3、异。变异的血红蛋白与正常变异的血红蛋白与正常的血红蛋白差异是在一条多的血红蛋白差异是在一条多肽链上第肽链上第6位的位的Glu被被Val替替代。由于代。由于Glu与与Val在形成氢在形成氢键上的差异很大，变异蛋白键上的差异很大，变异蛋白质的空间结构变化显著，水质的空间结构变化显著，水溶性降低，血液粘度增大，溶性降低，血液粘度增大，导致贫血症状。导致贫血症状。蛋白质氨基酸顺序的改变会引起异常功能或病变。蛋白质氨基酸顺序的改变会引起异常功能或病变。2蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构1952年英国生化学家年英国生化学家Sanger首次测定首次测定结构特点：结构特
4、点：1.由由51个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成2.分两条链：分两条链：A链：链：21个氨基酸残基个氨基酸残基,B链：链：30个氨基酸残基个氨基酸残基3.含三个二硫链：含三个二硫链：一个一个A链内的二硫键链内的二硫键,两个链间二硫键两个链间二硫键蛋白质一级结构的测定步骤蛋白质一级结构的测定步骤 1.1.肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的量与蛋白肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的量与蛋白质相对分子质量之间的关系质相对分子质量之间的关系,确定多肽链的数目确定多肽链的数目.2.2.多肽链的拆分多肽链的拆分:加入盐酸胍加入盐酸胍,解离非共价力解离非共价力,过氧酸氧过氧酸氧化或巯基还原法拆分二硫键化
5、或巯基还原法拆分二硫键.4.4.测定多肽链氨基酸顺序测定多肽链氨基酸顺序3.3.测定多肽链氨基酸组成测定多肽链氨基酸组成:酸水解酸水解,测定计算各测定计算各种氨基酸分子比种氨基酸分子比.多肽链氨基酸顺序分析多肽链氨基酸顺序分析1.多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解酶解法酶解法:胰蛋白酶胰蛋白酶化学法化学法:CNBr水解水解2.多肽链末端氨基酸的测定多肽链末端氨基酸的测定二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)法法:N端端丹磺酰氯法丹磺酰氯法:N端端阱解法阱解法:C端端3.Edman氨基酸顺序法氨基酸顺序法:N端端酶解法酶解法带正电荷的氨基酸带正电荷的氨基酸R1-Lys-Ala-R2R1-Lys-CO
6、O-+NH3+-Ala-R2胰蛋白酶胰蛋白酶RmRnRn预测端基氨基酸类型预测端基氨基酸类型思考题思考题用胰蛋白酶处理下列小肽，会断裂成什么样用胰蛋白酶处理下列小肽，会断裂成什么样的肽片断？的肽片断？Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Arg-Ser-Gly答案答案Ala-Ser-Thr-LysGly-ArgSer-Gly思考题今有一个九肽，分别用（今有一个九肽，分别用（1）胰蛋白酶）胰蛋白酶（2）胰凝乳蛋白酶（）胰凝乳蛋白酶（3）羧肽酶（）羧肽酶（4）溴）溴化氰处理，试用箭头及号码表示出它们对化氰处理，试用箭头及号码表示出它们对肽键作用的位置。肽键作用的位置。Leu-Met-Arg-Pr
7、o-Ala-Lys-Tyr-Ser-Arg化学方法化学方法溴化氰（溴化氰（CNBr）水解法）水解法:选择性地切割由甲硫氨酸选择性地切割由甲硫氨酸(Met)形成的肽键形成的肽键高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯思考题思考题一个肽用CNBr切成两个小肽段，又用切成两个小肽段，又用胰蛋白酶切成另外两个小肽段。胰蛋白酶切成另外两个小肽段。CNBr1,Gly-Thr-Lys-Ala-GluCNBr2,Ser-Met胰蛋白酶胰蛋白酶1,Ser-Met-Gly-Thr-Lys胰蛋白酶胰蛋白酶2,Ala-Glu推断该多肽的氨基酸顺序推断该多肽的氨基酸顺序.答案Ser-Met-Gly-Thr-Lys-Ala-Glu末端氨
8、基酸分析：末端氨基酸分析：包括包括N端分析，端分析，C端分析端分析N端分析方法端分析方法二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB)法法DNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）酸性水解酸性水解丹磺酰氯法丹磺酰氯法N端分析方法端分析方法丹磺酰氯丹磺酰氯丹磺酰氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度高丹磺酰氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度高肼解法肼解法C端分析方法端分析方法阱化物能与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与阱化物能与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离端氨基酸分离.Edman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法N端分析方法端分析方法异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯特点：特点：不断重复循环，将肽不断重复循环，将肽
9、链链N-端氨基酸残基逐一进行端氨基酸残基逐一进行标记和解离。标记和解离。PTH-苯乙内酰硫脲苯乙内酰硫脲蛋白质的空间结构（三维结构）蛋白质的空间结构（三维结构）天然活性蛋白质都有稳定的三维结构。一旦天然活性蛋白质都有稳定的三维结构。一旦这种三维结构遭到破坏，即使一级结构不变，这种三维结构遭到破坏，即使一级结构不变，蛋白质的生物功能也会完全丧失。蛋白质的生物功能也会完全丧失。具有独特的三维结构是蛋白质区别于普通有具有独特的三维结构是蛋白质区别于普通有机分子最显著的特征。机分子最显著的特征。1.1.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构是指肽链的主蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的
10、排列。只涉及肽链主链的链在空间的排列。只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。构象及链内或链间形成的氢键。多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳碳原子相隔。而原子相隔。而C C-C-C键和键和C C-N-N键是单键，可以自由旋转，键是单键，可以自由旋转，因此，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同因此，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同的空间排列。的空间排列。维持主链空间排列的另一个重要维持主链空间排列的另一个重要因素是氢键。因素是氢键。主链中的主链中的-C=O和和-N-H-能够相能够相互形成链内或链间的氢键。互形成链内或链间
11、的氢键。蛋白质二级结构主要有：蛋白质二级结构主要有：（1 1）-螺旋螺旋（2 2）-折叠折叠（3 3）-转角转角(1)-螺旋螺旋1950年美国年美国Pauling等人发现等人发现-螺旋是蛋白质中螺旋是蛋白质中最常见的二级结构。最常见的二级结构。主链按右手方向盘主链按右手方向盘绕成螺旋形，相邻螺圈绕成螺旋形，相邻螺圈之间形成链内氢键。之间形成链内氢键。(2)-(2)-折叠折叠-折叠主链骨架以一定折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的的折叠形式形成一个折叠的片层。片层。在两条相邻的肽链之间在两条相邻的肽链之间形成氢链。几乎所有的肽键形成氢链。几乎所有的肽键都参与了链间氢键交联。因都参与了链间氢
12、键交联。因此，结构牢固。此，结构牢固。(3)-转角转角由第一个氨基酸残基的由第一个氨基酸残基的C=OC=O与第四个与第四个氨基酸残基的氨基酸残基的NHNH之间形成氢键。之间形成氢键。不稳定的环状不稳定的环状结构，主要存结构，主要存在于球状蛋白在于球状蛋白分子中。分子中。2.2.蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，多肽链再进一步折叠盘绕成更复杂的空间结构。多肽链再进一步折叠盘绕成更复杂的空间结构。三级结构主要靠非共价键来维持。包括氢键、三级结构主要靠非共价键来维持。包括氢键、疏水键疏水键、离子键、范德华力等。、离子键、范德
13、华力等。1963年年Kendrew等通过肌红蛋白的等通过肌红蛋白的x-射射线衍射分析，测得了为它的三级结构。线衍射分析，测得了为它的三级结构。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构具有三级结构的多肽按一定的空间排列方式，具有三级结构的多肽按一定的空间排列方式，通过非共价键缔合在一起形成蛋白质大分子。通过非共价键缔合在一起形成蛋白质大分子。蛋白质一级结构和高级结构蛋白质一级结构和高级结构之间的关系之间的关系蛋白质的高级结构是在一级结构的基础上形成的，蛋白质的高级结构是在一级结构的基础上形成的，因此，一级结构的改变必然影响到它的高级结构。因此，一级结构的改变必然影响到它的高级结构。-螺旋的形成及其稳定性
14、取决于它的氨基酸组成螺旋的形成及其稳定性取决于它的氨基酸组成和排列顺序。氨基酸残基的和排列顺序。氨基酸残基的R基团比较小，不带基团比较小，不带电荷，有利于电荷，有利于-螺旋的形成和稳定。由于脯氨酸螺旋的形成和稳定。由于脯氨酸的特殊结构，肽链的主链在脯氨酸所在位置会发的特殊结构，肽链的主链在脯氨酸所在位置会发生骨架方向变化，不能形成内氢键。因此，多薹生骨架方向变化，不能形成内氢键。因此，多薹链只要存在脯氨酸，链只要存在脯氨酸，-螺旋即发生中断。螺旋即发生中断。几种重要的蛋白质类型几种重要的蛋白质类型纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白球状蛋白角蛋白角蛋白丝蛋白丝蛋白血红蛋白血红蛋白免疫球蛋白免疫球蛋
15、白抗体抗体球状蛋白球状蛋白结构最复杂，功能最多的一类蛋白质。结构最复杂，功能最多的一类蛋白质。结构紧密，分子外层为亲水性残基；内结构紧密，分子外层为亲水性残基；内部主要为疏水性氨基酸残基。部主要为疏水性氨基酸残基。血红蛋白血红蛋白结合蛋白质，血红结合蛋白质，血红素中的素中的Fe原子以配原子以配价键与肽链分子中价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的的组氨酸咪唑基的氮原子相连。氮原子相连。主要功能是运输氧主要功能是运输氧和二氧化碳。和二氧化碳。免疫球蛋白免疫球蛋白抗体抗体结合蛋白质，血浆糖蛋白。主要在脾、肝、结合蛋白质，血浆糖蛋白。主要在脾、肝、淋巴等组织的细胞内合成。淋巴等组织的细胞内合成。抗体是高等
16、动物免疫反应的产物，是机体防抗体是高等动物免疫反应的产物，是机体防止外界物质侵入的防御物质。当外来的大分止外界物质侵入的防御物质。当外来的大分子物质，如蛋白质、多糖、核酸以及细菌等子物质，如蛋白质、多糖、核酸以及细菌等侵入机体时，引起抗体的产生，这就是机体侵入机体时，引起抗体的产生，这就是机体的免疫反应。的免疫反应。抗体抗体就是免疫球蛋白，外来的大分子物质就就是免疫球蛋白，外来的大分子物质就称为称为抗原抗原。抗体的特点抗体的特点1.高度的特异性：高度的特异性：一种抗体一般只与相应的抗原发生作一种抗体一般只与相应的抗原发生作用，形成抗体用，形成抗体-抗原复合物。抗体抗原复合物。抗体-抗原复抗原复
17、合物一般不溶于水，常从溶液中沉淀出来，合物一般不溶于水，常从溶液中沉淀出来，称为抗体称为抗体-抗原沉淀反应。抗原沉淀反应。2.多样性：多样性：不同的抗原可以诱导产生不同的抗体。不同的抗原可以诱导产生不同的抗体。抗原种类的多样性决定了抗体的多样性。抗原种类的多样性决定了抗体的多样性。抗体蛋白抗体蛋白Ig(immuneglobulin)人的抗体蛋白分为人的抗体蛋白分为5类：类：IgA,IgD,IgE,IgG（含量最高）（含量最高）,IgM.抗体蛋白的相对分子质量范围：抗体蛋白的相对分子质量范围：150000950000习题课蛋白质蛋白质1.甘氨酸的解离常数是甘氨酸的解离常数是pK1=2.34,pK
18、2=9.60，它的等电点（，它的等电点（pI）是）是()A、7.26B、5.97C、7.14D、10.772.维持蛋白质二级结构稳定的主要因素是：维持蛋白质二级结构稳定的主要因素是：A、静电作用力、静电作用力B、氢键、氢键C、疏水键、疏水键D、范德华作用力、范德华作用力3.蛋白质变性是由于（蛋白质变性是由于（）A、一级结构改变、一级结构改变B、空间构象破坏、空间构象破坏C、辅基脱落、辅基脱落D、蛋白质水解、蛋白质水解选择题选择题4.在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋转的氨基酸是（转的氨基酸是（）A、丙氨酸、丙氨酸B、亮氨酸、亮氨酸C、甘氨酸、甘氨酸D、
19、丝氨酸、丝氨酸5.谷氨酸的谷氨酸的pK1(-COOH)为为2.19，pK2(-NH3)为为9.67，pK3(-COOH)为为4.25，其，其pI是是（）A、4.25B、3.22C、6.96D、5.936.在生理在生理pH情况下，下列氨基酸中哪个带净负情况下，下列氨基酸中哪个带净负电荷？（电荷？（）A、ProB、LysC、HisD、Glu7.蛋白质分子中蛋白质分子中-S-S-断裂的方法是（断裂的方法是（）A、加尿素、加尿素B、透析法、透析法C、加过甲酸、加过甲酸D、加重金属盐加重金属盐8.含有两个羧基的氨基酸是：（含有两个羧基的氨基酸是：（）。）。A.甘氨酸甘氨酸B.谷氨酸谷氨酸C.缬氨酸缬氨酸
20、D.甲硫氨酸甲硫氨酸9.所有的所有的-氨基酸共有的显色反应是：（氨基酸共有的显色反应是：（）A.茚三酮反应茚三酮反应B.双缩脲反应双缩脲反应C.坂口反应坂口反应D.福林酚福林酚试剂反应试剂反应10.下列关于氨基酸的叙述错误的一项是：（下列关于氨基酸的叙述错误的一项是：（）A.酪氨酸和苯丙氨酸含苯环酪氨酸和苯丙氨酸含苯环B.谷氨酸和天冬氨酸谷氨酸和天冬氨酸含两个氨基含两个氨基C.亮氨酸和缬氨酸是支链氨基酸亮氨酸和缬氨酸是支链氨基酸D.酪氨酸和丝氨酪氨酸和丝氨酸含羟基酸含羟基11.维持蛋白质一级结构的化学键是：（维持蛋白质一级结构的化学键是：（）A盐键盐键B疏水键疏水键C肽键肽键D.氢键氢键12.
21、多肽多肽GiyArsLyspheAsp（C）经）经Edman降解除去一个氨基酸后，其产物是：降解除去一个氨基酸后，其产物是：（）A.GlyArg（C）LyspheAsp（C）B.GlyArgLysphe（C）AspC.ArgLySpheAsp（C）GlyD.ArgLysphe（C）GlyAsp13.下列肽链不能形成下列肽链不能形成-螺旋的一个是：（螺旋的一个是：（）AIle-Asn-Met-Val-GlnBTrp-Val-Gly-Ala-AsnCAla-Pro-Tyr-phe-GlnDSer-Phe-Ala-Gln-Lys14.有一混合的蛋自质溶液，各种蛋自质的有一混合的蛋自质溶液，各种蛋自质
22、的pI为为4.6、5,0、5.3、6.7,7.3,电泳时欲使其电泳时欲使其中四种泳向正极，缓冲液的中四种泳向正极，缓冲液的pH值应该是：值应该是：（）A5.0B.6.0C7.0D8.015.从组织提取液沉淀活性蛋白而又不使之变从组织提取液沉淀活性蛋白而又不使之变性的方法是加入性的方法是加入A硫酸铵硫酸铵B三氯乙酸三氯乙酸C氯化汞氯化汞D1molLHCl16.可用于测定蛋白质分子量的方法是：（可用于测定蛋白质分子量的方法是：（）ASDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳B离子交换层析离子交换层析C凯氏定氮法凯氏定氮法D亲和层析亲和层析17.下列方法中可用于蛋白质多肽链下列方法中可用于蛋白质多肽
23、链N未端的氨基酸分未端的氨基酸分析法是：（析法是：（）A茚三酮法茚三酮法B二硝基氟苯法二硝基氟苯法CEdman降解降解D丹磺酞氯法丹磺酞氯法18.下列方法中可用于蛋自质多肽链下列方法中可用于蛋自质多肽链c未端的氨基酸分未端的氨基酸分析的方法是：（析的方法是：（）AEdman降解降解B肼解法肼解法C硼氢化银还原法硼氢化银还原法D羧肽酶法羧肽酶法19.分离纯化蛋白质可用离子交换层析法，其原理是：分离纯化蛋白质可用离子交换层析法，其原理是：（）A蛋白质的溶解度不同蛋白质的溶解度不同B组成蛋白质的氨基酸种类和数目不同组成蛋白质的氨基酸种类和数目不同C蛋白质分子能与其对应的配基进行特异性结合蛋白质分子能
24、与其对应的配基进行特异性结合D蛋白质所带电荷不同蛋白质所带电荷不同填空题填空题1.构成蛋白质的氨基酸的构型除甘氨酸外均为构成蛋白质的氨基酸的构型除甘氨酸外均为型型2.含巯基的氨基酸是。两个通过含巯基的氨基酸是。两个通过氧化巯基形成键而在稳定蛋白质的结氧化巯基形成键而在稳定蛋白质的结构中起重要作用。构中起重要作用。3.蛋自质分子中，肽链是由一个氨基酸的蛋自质分子中，肽链是由一个氨基酸的基与后一个氨基酸的基缩合而成的。基与后一个氨基酸的基缩合而成的。其中的每一个氨基酸单位称为氨基酸其中的每一个氨基酸单位称为氨基酸4.维持蛋自质一级结构的共价键有键维持蛋自质一级结构的共价键有键和键。和键。5.在在-
25、折叠片层中，多肽链间依靠相邻肽链折叠片层中，多肽链间依靠相邻肽链间形成的键来维持结构的稳定性。间形成的键来维持结构的稳定性。6.-转角结构是由第一个氨基酸残基的转角结构是由第一个氨基酸残基的C=O与第个氨基酸残基的与第个氨基酸残基的N-H之间形成之间形成键而构成的。键而构成的。7.某一种蛋白质，其氨基酸组分中富含谷氨某一种蛋白质，其氨基酸组分中富含谷氨酸和天冬氨酸，它的酸和天冬氨酸，它的pI值可能会偏。值可能会偏。8.判断题判断题1.在溶液的在溶液的pH为为7时赖氨酸在电场中向正极时赖氨酸在电场中向正极方向移动。方向移动。2.Edman降解反应中降解反应中PTC是与氨基酸的是与氨基酸的-羧羧基
26、形成基形成PTC-氨基酸。氨基酸。3.在在2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反应中，氨基）反应中，氨基酸的酸的-氨基与氨基与DNFB反应形成黄色的反应形成黄色的DNP-氨基酸。该反应可用于肽链的氨基酸。该反应可用于肽链的C-未端氨基酸未端氨基酸的鉴定。的鉴定。4.一个六肽的结构是一个六肽的结构是Glu，His，Arg，ValLys。Asp，该肽在，该肽在pH11时向正极迁移。时向正极迁移。5.对同一种蛋自质而言，在氨基酸组分固定后，对同一种蛋自质而言，在氨基酸组分固定后，它的氨基酸顺序可以随机排列。它的氨基酸顺序可以随机排列。6.在可溶性球蛋白中，苯丙氨酸、色氨酸、亮在可溶性球蛋白中，苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸等含疏水性基团的氨基酸大多分布在球氨酸等含疏水性基团的氨基酸大多分布在球蛋白分子内部形成疏水内核。蛋白分子内部形成疏水内核。7.透析和盐析的原理是相同的。透析和盐析的原理是相同的。8.用凝胶过滤层析（分子筛层析）分离蛋白质用凝胶过滤层析（分子筛层析）分离蛋白质时，总是分子量小的先下来，分子量大的后时，总是分子量小的先下来，分子量大的后下来。下来。9.在在SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳中，总是分子聚丙烯酞胺凝胶电泳中，总是分子量小的蛋白质的迁移较快，分子量大的迁移量小的蛋白质的迁移较快，分子量大的迁移较慢。较慢。