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1、基因的克隆与表达基因的克隆与表达基因克隆基因克隆(genecloning)基因表达基因表达(geneexpression)-原核基因表达原核基因表达 -真核基因表达真核基因表达基 因 克 隆 Gene Cloning概述概述克隆载体克隆载体受体细胞受体细胞体外重组的策略体外重组的策略基因克隆工作流程基因克隆工作流程一、概述确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码1973年年Cohen完成第一个基因工程实验完成第一个基因工程实验经经体外重组体外重组获得杂合获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆
2、菌杂合子转化入大肠杆菌所需元件：所需元件：限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶载体载体受体细胞受体细胞基因克隆（分子克隆基因克隆（分子克隆molecularcloning）-通过体外重组技术通过体外重组技术,将一将一段目的段目的DNA经切割、连接插入适当经切割、连接插入适当载载体体，并导入，并导入受体细胞受体细胞，扩增形成大量，扩增形成大量子代分子的过程。子代分子的过程。基因克隆的核心基因克隆的核心-体外重组体外重组(Recombination):人工将一段目的人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。插入一个载体的过程。基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线目的基因目的基因载体载体体外重组体外重
3、组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA二、克隆载体二、克隆载体复制基因(replicator)选择性记号克隆位点三、受体细胞三、受体细胞1 1、定义：外源、定义：外源DNADNA导入的细胞，是重导入的细胞，是重组体扩增的场所。组体扩增的场所。2 2、要求：易于接纳外源、要求：易于接纳外源DNADNA 无特异的内源性核酸内切酶无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性与载体有互补性四、体外重组的策略四、体外重组的策略1 1、粘末端连接、粘末端连接1 1）全同源粘末端连接）
4、全同源粘末端连接 最方便简单最方便简单 高背景高背景-载体自身环化载体自身环化 双向插入双向插入2 2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略中的克隆策略粘粘-粘连接：最有效、最快捷粘连接：最有效、最快捷粘粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平一个相同酶切位点，可将另一末端补平2 2、平末端连接：、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平酶切点为平末端或任何两个末端补平的的DNADNA效率低，酶用量大效率低，酶用量大3 3、人工接头连接、人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡
5、人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段核苷酸片段4 4、T-AT-A克隆克隆T-vectorT-vector两条链的两条链的55端含有一个端含有一个游离的游离的T TPCRPCR过程中，普通的过程中，普通的TaqTaq酶可在产物酶可在产物的的33端多加一个端多加一个A A五、基因克隆的工作流程五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得（一）目的基因的获得1 1、直接分离、直接分离3 3、构建、构建cDNAcDNA文库文库4 4、PCRPCR5 5、人工合成、人工合成6 6、差异显示、差异显示1 1、直接分离、直接分离DNADNA适用于克隆原核生物的适用于克隆原核生物的基因组文库基因组文库
6、2 2、构建基因组文库，筛选目的基因、构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库基因组文库(gene library)gene library)：将某将某种生物的基因组种生物的基因组DNADNA切割成一定大小切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组于所有重组体内的基因组DNADNA片段的片段的集合，即基因组文库，它包含了该集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。生物的所有基因。构建流程构建流程抽提基因组抽提基因组DNADNA鸟枪法制备鸟枪法制备DNADNA片段片段DNADNA片
7、段与载体重组片段与载体重组转化宿主菌转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）免疫结合法）特点及应用：特点及应用：包含所有遗传信息包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况用于研究基因在基因组中的情况3 3、构建、构建cDNAcDNA文库，筛选目的基因文库，筛选目的基因cDNAcDNA文库文库(complementary DNA complementary DNA library)library)以组织细胞中的以组织细胞中的mRNAmRNA为模板，为模板，反转录合成双链
8、反转录合成双链cDNAcDNA ，各各cDNAcDNA分子分子分别插入载体形成重组子，再导入宿分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNAcDNA的集合即的集合即cDNAcDNA文库。文库。cDNAcDNA文库仅包含正在表达的基因文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的不同物种、不同组织的cDNAcDNA文库不相同文库不相同基因总量少，易筛选基因总量少，易筛选4 4、PCRPCR扩增目的基因片段扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因适用于克隆序列清楚的基因以基因组以基因组DNADNA为模板，直接进行为模板，直接进行PCRPCR扩
9、扩增较难增较难多采用以多采用以mRNAmRNA为模板的为模板的RT-PCRRT-PCR法法5 5、人工合成较短的、人工合成较短的DNADNA6 6、差异显示法、差异显示法(differential display,(differential display,DD)DD)筛选差异表达的基因筛选差异表达的基因（二）体外重组（二）体外重组连接体系的建立：连接体系的建立：温度：粘末端连接：温度：粘末端连接：12-1812-18 平末端连接：室温（低于平末端连接：室温（低于30)30)DNADNA量：载体分子数量：载体分子数/目的基因分子数目的基因分子数=1=1：1-31-3酶量：平端连接时需加大酶量酶
10、量：平端连接时需加大酶量（三）转化（三）转化CaclCacl2 2法、电击法法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定（四）重组子的筛选及鉴定1 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）原位杂交原位杂交2 2、鉴定：、鉴定：长度鉴定：酶切、长度鉴定：酶切、PCRPCR方向鉴定：联合酶切方向鉴定：联合酶切测序测序基因的表达基因的表达 Gene Expression一表达系统：一表达系统：基基因因工工程程中中用用来来获获得得有有功功能能的的异异源源蛋蛋白白质质的的体体系系，包包括括克克隆隆载载体体，表表达达载载体体及及受体细胞。受体细胞。据受体细胞的不同可分为：据受体细胞的不同可
11、分为：1原核表达系统原核表达系统：将将外外源源基基因因引引入入原原核核细细胞胞，并并使使其其在在原原核核细细胞胞中中以以发发酵酵形形式式快快速速高高效效地地表表达达、合成基因产物的体系。合成基因产物的体系。2真核表达系统真核表达系统：使外源基因在真核细：使外源基因在真核细胞中表达的体系。胞中表达的体系。二原核生物基因结构和表达特点二原核生物基因结构和表达特点1.原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的环形是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续其转录和翻译是偶联的连续进行。进行。2.原核生物形成原核生物形成多顺反子多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体在合成过程中和多个核糖体
12、结合，翻译形成多条肽链。结合，翻译形成多条肽链。3、一般不含内含子（、一般不含内含子（intron），没有转），没有转录及翻译后加工系统录及翻译后加工系统4、原原核核生生物物中中功功能能相相关关的的基基因因串串联联在在一起，形成一起，形成操纵子操纵子。操纵子（操纵子（operon）：是一组功能上相：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位一个遗传单位原原核核生生物物基基因因表表达达的的基基本本单单位位（即即一一个转录单位）。个转录单位）。共共同同协协调调作作用用，完完成成某某一一多多肽肽的的表表达达调控。调控。包包括括：调调控控区区(调调节节基
13、基因因，启启动动基基因因，操作基因操作基因)、结构基因结构基因5、原核生物中参与转录的基因结、原核生物中参与转录的基因结构：构：启动子启动子终止子终止子启动子启动子(promoter,P)是指能被是指能被RNA聚合聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。序列。一般长一般长40-60bp，富含富含A-T碱基对碱基对具有保守序列：具有保守序列：-10区（区（pribnow box）：）：TATAAT -35区：区：RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录各种启动子启动转录能力不同。各种启动子启动转录能力不同。启动子强
14、弱取决于启动子强弱取决于-35区和区和-10区的碱基组成及其间区的碱基组成及其间隔序列隔序列终止子（终止子（terminatorterminator，T T）:位于基因位于基因33端端,给予给予RNARNA聚合酶转录终止信号的聚合酶转录终止信号的DNADNA序序列列 6、与与转转译译有有关关的的原原核核细细胞胞结结构构：核糖体结合位点核糖体结合位点转译起始密码子转译起始密码子AUG 或或GUGSD顺序顺序（shine-dalgarno）：）：AUG上游上游3-11 bp长约长约3-9bpmRNA与与16s核核糖糖体体亚亚基基间间的的识识别别与与结合序列结合序列 三三外外源源基基因因在在原原核核
15、表表达达系系统统中中表表达达的必要条件的必要条件：1.删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区2.外外源源基基因因置置于于强强启启动动子子和和SD顺顺序序控控制制下下3.维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解白质不被降解四四影影响响外外源源基基因因在在原原核核细细胞胞中中表表达效率的因素达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子。常见原核强启动子常见原核强启动子：Plac：受受Lac阻阻遏遏蛋蛋白白负负调调，受受IPTG的的诱导诱导Ptrp：取自大肠杆
16、菌色氨酸操纵子。取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启启动动子子和和Trp启启动动子子的的杂杂合合启启动子。动子。PL和和PR启动子启动子：噬菌体早期左：噬菌体早期左/右向启右向启动子，受动子，受噬菌体噬菌体CI基因负调控。温度基因负调控。温度诱导。诱导。2、基因剂量：、基因剂量：3、核糖体结合位点：、核糖体结合位点：SD顺序与顺序与16srRNA3末端互补程度。末端互补程度。AUGSD间距离。间距离。AUG后的核苷酸后的核苷酸五原核表达载体：五原核表达载体：适用于在原核细胞适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD顺序顺序 筛
17、选标志筛选标志 其它调控基因其它调控基因类型：类型：融合型表达载体：融合型表达载体：-融合蛋白融合蛋白非融合型表达载体：非融合型表达载体：-天然完整蛋白天然完整蛋白分泌型表达载体：分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌产物可跨膜分泌至胞周间隙至胞周间隙（一）融合型表达载体（一）融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因技术关键技术关键：克隆基因插入原核序列：克隆基因插入原核序列33端而维持正确阅读框架端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点选择合适酶切位点加人工合成的加人工合成的DNA接头接头构建位相载体构建位相载体-ATG-AACCTGGAATTCCTAGG
18、T-TAC-TTGGACCTTAAGGATCCA-EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载体部分序列载体部分序列DNA序列序列位相载体位相载体-含有含有3种读码框的系列载体种读码框的系列载体优点：优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易易鉴鉴定定：融融合合蛋蛋白白分分子子量量大大，电电泳泳可可鉴定鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便：pGEX-1 T凝血酶凝血酶pGEX-2T-凝血酶凝血酶pGE
19、X-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列（二）非融合型表达载体（二）非融合型表达载体PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD：ATG：第一个密码子：第一个密码子非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子启动子-温度温度诱导诱导插入位点插入位点-HpaI（三）分泌型表达载体：（三）分泌型表达载体：1、主要元件：、主要元件：启动子和启动子和SD序列序列信信号号肽肽序序列列：SD下下游游，编编码码信信号号肽肽，可引导蛋白跨膜可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。
20、、优点：分泌表达，避免降解。分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA1分泌型融合表达载体分泌型融合表达载体-pEZZ18六提高表达水平的手段六提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子强启动子-提高转录水平提高转录水平核糖体结合位点（核糖体结合位点（ATG-SD）避免产物降解避免产物降解：分泌：分泌/融合表达融合表达 细菌蛋白酶抑制剂细菌蛋白酶抑制剂2、选择合适宿主、选择合适宿主 Lac 启动子启动子-LacI菌菌PL/PR -CI857 溶源菌溶源菌3、诱导表达、诱导表达温度诱导温度诱导-PLPR/IPTG的化学诱导的化学诱导-Plac
21、、Ptac4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解主降解七表达产物的检测：七表达产物的检测：1、特异性鉴定：、特异性鉴定：荧光抗体法荧光抗体法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫印迹法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定生物学活性鉴定八、原核表达系统的缺点八、原核表达系统的缺点1、没有转录后加工系统，不能识别、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子剪除内含子2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工的蛋白质进一步修饰加工真核表达系统的必要性及优势真核表达系统的必要性及优势1.具转录后加工系统具转录后加工系统2.具翻译后修饰系
22、统具翻译后修饰系统3.可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达4.基因治疗基因治疗真核基因结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点（一）真核基因组的复杂性（一）真核基因组的复杂性真核基因组庞大，真核基因组庞大，具大量非编码序列具大量非编码序列-mRNA丰度不同丰度不同结构复杂结构复杂：染色质、核膜、线粒体：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样表达调控多样不连续性：内含子、外显子不连续性：内含子、外显子没有操纵子结构没有操纵子结构(二）真核表达系统二）真核表达系统组成：真核表达载体组成：真核表达载体受体细胞受体细胞基因转移方式基因转移方式据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3种：种：酵母表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统（三）转化（三）转化1、原生质体法：去除厚壁、原生质体法：去除厚壁2、电穿孔法：效率较高、电穿孔法：效率较高（四）外源基因的表达（四）外源基因的表达1、胞内表达、胞内表达2、分泌表达：在、分泌表达：在MCS前加入信号肽前加入信号肽序列序列（五）缺点（五）缺点不能实现全部的翻译后修饰功能不能实现全部的翻译后修饰功能