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1、 DNA克隆技术克隆技术许丽辉许丽辉 目目 录录目目 录录一、概述一、概述（一）基本概念（一）基本概念 1 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。2 动物克隆动物克隆3 杂交杂交目目 录录克隆羊：克隆羊：个体水平个体水平细胞克隆：细胞克隆：细胞水平细胞水平DNA克隆：克隆：分子水平分子水平目目 录录卵细胞C母绵羊子宫母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠目目 录录 4 4 重组重
2、组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段目目 录录目目 录录5 DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得
3、大大量量同同一一DNA分分 子子，也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA(recombinant DNA)。目目 录录生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）6 基因工程基因工程(genetic engineering)实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。目目 录录人体生长激素释放
4、激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg-5050万只羊脑万只羊脑基因工程9 9升大肠杆菌升大肠杆菌 培养液目目 录录目目 录录（二）重组（二）重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。19
5、80年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉目目 录录19721972年年,P.Berg:,P.Berg:构建第一个构建第一个DNADNA重组分子重组分子19971997年年,动物克隆动物克隆:克隆羊多莉克隆羊多莉19771977年，基因工程产品的出现年，基因工程产品的出现 ,第一个基因工程产品第一个基因工程产品第一个基因工程产品第一个基因工程产品(SS)(SS)(SS)(SS)19731973年年,:,:第一个基因克隆实验第一个基因克隆实验 2001年，人类基因组
6、计划年，人类基因组计划目目 录录 重组重组DNA医药产品医药产品目目 录录目目 录录（三）重组（三）重组DNA技术技术路线技术技术路线目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 目目 录录二、重组二、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶目目 录录（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶1 核酸酶的分类核酸酶的分类2 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的
7、的特特异异序序列列,并并在在识识别位点或其周围切割双链别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。3 命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录
8、5共性共性 （1）只作用于双链）只作用于双链DNA （2）活性有赖于）活性有赖于Mg2+（3）碱基识别特异性）碱基识别特异性 （4）切口形式）切口形式6 使用原则及注意事项使用原则及注意事项 4 分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切
9、口目目 录录n（二）大肠杆菌（二）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n（三）（三）T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶n（四）（四）TaqDNA聚合酶聚合酶n（五）反转录酶（五）反转录酶n（六）连接酶（六）连接酶n（七）末端（脱氧核苷酸）转移酶（七）末端（脱氧核苷酸）转移酶n（八）碱性磷酸酶（八）碱性磷酸酶目目 录录 三三 目的基因及载体的分离目的基因及载体的分离（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取 直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离中分离 人工合成人工合成 1.601.60元元/碱基碱基 基因文库基因文库 反转录反转录PCR PCR mRNA cDNAmRNA cDNA PCR PCR 直
10、接索取直接索取分分分目目 录录 （二）（二）基因载体基因载体定义定义能携带目的基因进入宿主细胞并且在能携带目的基因进入宿主细胞并且在宿主细胞中进行扩增和表达的一类宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分分子。子。1 载体的种类载体的种类质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目目 录录（1 1）质粒）质粒(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些遗传信息些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列
11、（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（2）噬菌体）噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列目目 录录n（3）病毒载体）病毒载体n（4）粘性质粒）粘性质粒目目 录录2 载体的条件载体的条件n有扩增所需的复制起始点，即能自主复制；有扩增所需的复制起始点，即能自主复制；n有多克隆位点（外源有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点；多个单一酶切位点；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；n表达型载体必须具有指
12、导基因表达的调控元表达型载体必须具有指导基因表达的调控元件。件。目目 录录多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记A Ammp ppolylinker基因载体基因载体目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录抗抗AmpAmp宿主细菌宿主细菌含含Amp培养基培养基目目 录录 标志补救（标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段目目 录录X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal目目 录录（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 C
13、 C端序列端序列LacZLacZ酶酶目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC
14、)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他载体其他载体目目 录录四 限制性内切酶剪切目的基因与载体切酶切目目 录录Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接目目 录录目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点B
15、g l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目目 录录目目 录录磷酸二酯键的形成DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶五、目的基因与载体的连接接目目 录录 T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）15：15/6h；12/8h；8/12h；目目 录录 连接方式 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 目目 录录粘端连接CC
16、GG CCGGCCGG CCGGGGCC GGCCGGCC GGCC CGG CCGG C C GGCC GGCCGG CCGG C C GGCC GGC CCGGCCGG GGCCGGCCHapHapT4-DNAT4-DNA连接酶连接酶目目 录录平端连接 AGCTAGCT TCGATCGAAluAluDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶AGCT AGCTAGCT AGCTTCGA TCGATCGA TCGA目目 录录目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录目目 录录六
17、、重组体的转化六、重组体的转化受体细胞转目目 录录转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变目目 录录CaCl2处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌目目 录录JM109感受态含氨苄平板含氨苄平板AmAm重组质粒感受态目目 录录转化后的克隆群体：目目 录录含氨苄平板含氨苄平板连接连接目的基因目的基因基因载体基因载体连接酶连接酶转化转化七、重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞宿主细胞目目 录录（一）初筛：遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段
18、AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板目目 录录2 2）标志补救（）标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段目目 录录X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal目目 录录 互互补补的的检检测测目目 录录目目 录录（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 C C端序列端序列LacZLacZ酶酶目目 录录（二）酶切鉴定凝胶电泳检测加样孔DNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组
19、质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段目目 录录（三）DNA序列检测ACTGAAGGCT目目 录录原位杂交原位杂交（四）菌落杂交筛选法目目 录录（五）免疫化学检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+目目 录录 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线目目 录录外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（E.coliE.coli）受体细胞表目目 录录 1 E.coli表达体系优势：一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达目目 录录不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。
20、2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。目目 录录 2目的基因在E.coli中的高效表达 三个因素：强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象目目 录录3目的基因表达产物的检测1）蛋白质的PAGE对照 样品 MarkerMarker目目 录录2）表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达目目 录录 3目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白目目 录录 DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然
21、的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分 子子，也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA(recombinant DNA)。目目 录录重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合
22、成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录目目 录录基因载体基因载体目的基因目的基因 质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 病毒病毒病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA 人工合成人工合成人工合成人工合成 基因文库基因文库基因文库基因文库限制性内切酶限制性内切酶有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因DNADNA连接酶连接酶
23、 重组体重组体 转化转化转化转化 转染转染转染转染 体外包装体外包装体外包装体外包装带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 表型筛选表型筛选表型筛选表型筛选 电泳法电泳法电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法目的基因的表达目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录目目 录录