《人工种子》PPT课件.pptx

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1、人工种子体细胞胚的发生和人工种子制作上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 种子seedp裸子植物和被子植物特有的繁殖体p由胚珠经过传粉受精形成上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 种子结构p种皮n保护作用p胚乳n为发育中的胚提供营养p胚n发育成新的植物体上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 单子叶植物种子结构子叶上胚轴胚根胚乳人工种子的定义p别名：合成种子、人造种子、无性种子、种子类似物p将植物离体培养中产生的胚状体（体胚）或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等），包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。上海海洋大学 细

2、胞工程 黄林彬 人工种子结构p最外面一层是人工种皮n人造的化合物，维持胚状体正常发育n透水透气、固定成型、耐机械冲击p中间是人工胚乳n营养成份和生长调节剂p种子内面则是被包埋的胚状体或类似物n具生命的物质结构，发育成植物体上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 半夏人工种子上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 概念的提出p1978年，加拿大，第四届国际植物组织培养会议p利用植物组织培养中具有体细胞胚胎发生的特点p著名的植物组培专家Murashige首次提出“人工种子”的概念p人工种子具有巨大的应用潜力，引起了各个国家的高度重视，列入高技术发展计划上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 种子导弹上海海洋大学 细胞工程

3、 黄林彬 一、为什么要进行人工种子研究？p人工种子不仅能像天然种子一样可以贮存、运输、播种、萌发和成长为正常植株p人工种子技术有着诱人的前景上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p第一，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的影响，且具有省地、省工、可直接在田间播种等优点p第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，使长成的植株具备优良特性上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率p第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产上海海洋大学 细胞工程 黄

4、林彬 1生产不受自然条件的限制和土地的制约p天然种子在农业生产上受季节限制n一般1年只能繁殖1-2次p人工种子可在实验室内大量生产，不受限制n一个体积为12L的发酵罐在二十天内可生产1000万粒人工种子上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 2快捷高效的繁殖方式，缩短育种时间p一个新的水稻品种用常规方法培育需要七到八年时间p而用人工种子与常规育种结合良种繁育技术减少了移栽驯化过程，只需三四年时间上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3人为赋予种子多种优良品质p在人工种子的制作过程中，可以加入某些农药、有益微生物或生长调节物质，人为地控制植物的生长发育，播种后生长出来的植物就有一定的抗逆性p通过转基因技术，使

5、离体培养的“胚”具有优良特性上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4固定杂种优势p天然种子是有性繁殖获得的，在遗传上具有因减数分裂引起的遗传重组分离现象p杂种优势只能体现在F1代，而F2代便参差不齐了p人工种子属于无性繁殖范畴，可以保持杂种优势p对于一些自然繁殖困难的名贵品种，也可通过人工种子进行快速大量繁殖上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 植物人工种子技术内容体细胞胚的诱导体细胞胚发生的同步控制人工种子的包裹人工种子的储存和萌发上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 二、体细胞胚的诱导二、体细胞胚的诱导上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 1.体细胞胚的概念p由孢子体或配子体的细胞通过无性繁殖产生的一种类似于合子

6、胚的结构p主要指在组织和细胞培养过程中，起源于非合子细胞（体细胞）并经过多次分裂产生的一种与胚相似的结构上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 2体细胞胚的特点p组织培养或细胞培养的产物p起源于体细胞（非合子细胞），区别于由卵和精子受精形成的合子胚p具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构p发育过程与合子胚相同n原胚心形胚鱼雷形胚具子叶的成熟胚上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 拟南芥植物野生型的胚胎发育阶段上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 心形胚鱼雷形胚成熟胚原胚芒果体胚发生由球型胚(A)，心型胚(B)，进入鱼雷胚(C)，萌芽(D)至植株再生(E)情形上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3体细胞胚来源p1958年，Re

7、inert在胡萝卜的组织培养中最早发现了体细胞胚p至今已从43科，92属，100种以上植物中获得了体细胞胚上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3-1 从器官上发生p离体培养的器官在一定条件下可以从外植体上直接产生胚状体n器官外植体的表皮细胞n外植体内部的薄壁细胞p子叶和下胚轴：最容易诱导体细胞胚发生上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3-2 从愈伤组织上发生p最常见的方式p离体器官愈伤组织胚状体n 脱分化 分化p能产生胚状体的愈伤组织：胚性愈伤组织n多数来自callus的表面细胞：玉米、西洋参n少数来自callus的内部：猕猴桃上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p体胚原始细胞的特点n原生质较浓n细胞核显

8、著增大、位于细胞质的中央上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 原始细胞顶端细胞基 细胞原胚体胚胚柄3-3 从游离的单细胞发生1.体细胞2.分离的原生质体3.小孢子等p在胡萝卜上研究较多上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 单离细胞小细胞薄壁细胞退化原胚心脏形胚大细胞丝状细胞体细胞胚上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p制作人工种子的核心p保证人工种子具有发芽力及转换为正常植株n体胚的诱导n获得高质量的体胚n要求体胚发育完整、生长健壮p在无菌试管培养条件下，有90%以上的体胚能正常萌发并转换为完整小植株体胚转换过程1萌发（胚轴的伸长）2旺盛的根系发育3苗端的生长与发育4产生两片以上真叶5有正常表现型的绿色植株上

9、海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4 影响体胚发生和发育的因素p胚状体的诱导和发生是一个十分复杂的过程p大量研究：形态学、细胞学、生理学和分子生物学等不同的角度p其机理至今仍不清楚，亟需解决p植物材料的内在因素和组织培养的外部条件影响胚状体的发生和发育上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4-1 供体植物的基因型a不同物种产生胚状体的能力不同p茄科植物n矮牵牛：容易产生胚状体n烟草：很少产生，一般通过根芽的分化形成再生植株上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 b同一物种的不同品种之间产生胚状体的能力也不同p水稻的11个品系n1个品系的callus能产生胚状体p紫狼尾草的21个品系n19个品系产生胚状体n2个品

10、系不能形成上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4-2 外植体的来源p大多数植物只有处于一定发育阶段的某一种器官的外植体能产生胚状体n双子叶植物：下胚轴和子叶n禾谷类：幼胚的盾片和幼穗n大黍：结构已发育完全但尚未伸展的黄绿色幼叶才能产生胚性愈伤组织n长春藤：成熟的茎段上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p芹菜、人参、葡萄、甘蔗的组织培养p离体产生的胚状体可以再次作为外植体，经继代培养能够产生大量的次级和三级胚状体p利用胚状体进行连续培养快速繁殖种苗上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p在继代培养过程中，胚状体的发生能力会逐渐降低n染色体发生倍性改变和畸变n例外：柑橘的callus分化胚状体的能力能保持8年以

11、上上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p不同植物callus分化胚状体的速度不同n咖啡：70天n人参：8个月上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4-3培养物的生理状况p培养细胞的内源激素水平p不同采样时期的外植体p采用增殖能力较强的外植体p获得较多的体细胞胚上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4-4 培养物的倍性p体细胞胚可以从不同倍性的组织中获得n单倍性的小孢子（花粉）n二倍体、三倍体、多倍体体细胞p倍性水平不影响体细胞胚的发生p但体细胞胚的发育和转换过程会有差异上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4-5 培养基中的外源激素p根据不同植物对外源激素的需求分3种情况n全过程不需要外源激素n添加少量会提高诱导频

12、率n诱导胚状体的全过程需要外源激素n较高的激动素和生长素的配比才有较高的频率（咖啡）n前期需要激素，后期不需要或极低浓度即可n常见，激素诱导出后callus，诱导胚状体无需激素（或很低）上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 生长素auxinp在不少植物中已被证明是胚胎发育所必须的p2,4-D是诱导多种植物离体培养的体细胞转变成胚性细胞的重要激素，其次是NAAp据Evans等分析有57.7%的双子叶植物和所有的单子叶植物在其体细胞胚胎发生的诱导阶段都使用2,4-D上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 2,4-Dp绝大多数研究证明：极为重要的诱导因子n外植体细胞脱分化n愈伤组织脱分化n愈伤组织诱导n胚性细胞的

13、形成p单子叶植物要求浓度较高：0.5mg5mg/Lp双子叶植物要求浓度较低：0.02mg1mg/L上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p不同植物的体胚发生，要求不同的激素种类n颠茄：NAA和激动素n南瓜：NAA和IBA上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 细胞分裂素CTKp裸子植物，CTK的作用比生长素更重要，特别有利于子叶的发育p添加生长素可提高体细胞胚的发生频率上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p玉米素n一种天然的细胞分裂素n促进胡萝卜体胚的发生n猕猴桃的胚乳callus只有在培养基中添加玉米素才能分化出体胚上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 其他激素pABA（脱落酸）n生长抑制剂n抑制次级胚和不正常胚的

14、产生并促进正常胚的发育和成熟pGA3（赤霉素）n促进生长的激素，多数植物不需要n在诱导胚胎发生的时候起抑制作用n能解除花菱草体细胞胚的休眠上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4-6 培养基成分对体胚形成的影响p还原态的氮（铵盐）的浓度直接影响胚状体的诱导效果nMS培养基White培养基n故：MS培养基比White培养基对胚状体的形成有更好的效果p培养基中添加有机氮源（水解酪蛋白、氨基酸）有利于胚状体的发生上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 氮N源p碳水化合物能维持组织培养中外植体的渗透压，同时又作为体胚发育的能源p其种类和浓度可以影响体胚的生长发育n苹果叶片离体培养时，在保证C源供应的前提下，降低蔗糖

15、浓度有利于体胚发生n高浓度的葡萄糖（6-10%）有利于胡萝卜的体胚发育上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 碳C源p椰子乳被认为是对体胚发生最有效的物质n液体胚乳，对胚的生长发育有明显的促进作用p其它未成熟的胚乳n玉米胚乳、水稻胚乳、小麦胚乳n对胚的生长也有一定作用p酵母、麦芽、酪蛋白等提取物对促进体胚的产生和发育，都是较为有效的天然物质上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 天然提取物p吸附一些外植体分泌出的有毒物质p提高体胚的诱导频率和生长发育上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 活性炭4-7环境因子p光照n烟草体胚发生需要高强度的光照n胡萝卜：完全黑暗也可完成n高强的白光、蓝光抑制胡萝卜体胚发生和生长n蓝光

16、可促进心形胚中ABA(脱落酸)的合成n红光促进心形胚的发育n远红光的短时间照射可以促进体细胞胚的发生上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 光照p温度n研究不多n在花粉胚的诱导培养中被证明是有效的n在柑橘属callus诱导培养中，随着培养温度的下降胚胎发生能力下降n对花菱草体细胞胚的冷处理可以部分解除其休眠状态上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 温度p体胚的培养可以从液体到半固体范围内进行p一般认为：培养器的种类、胚在培养基中的状态（浸入或漂浮）和培养基的物理状态（半固体或液体，通气性）对胚的形成和发育影响很小上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 培养基状态培养器的种类三、体细胞胚发生的同步控制三、体细胞胚发生

17、的同步控制上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 为什么要进行同步控制？p体胚发生的不同步性是普遍现象n在同一外植体上有不同发育时期的体胚p对于研究体胚的分化机制和生化调控带来麻烦p不利于人工种子的制作和生产上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 如何进行同步控制同步脱分化促进细胞的同步分裂分离过筛在悬浮培养中控制通气利用渗透压控制胚的同步生长上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 1.同步脱分化p在细胞培养初期加入DNA合成抑制剂（5氨基尿嘧啶），使其暂停DNA合成p1224h处理p除去抑制剂后细胞开始进入同步分裂p1016h，细胞出现有丝分裂高峰p低温处理抑制细胞分裂，然后把温度提高到正常水平，亦能达到部分同步化

18、的目的上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 2.分离过筛p根据体细胞胚发育的各个阶段细胞大小不同，利用尼龙筛过滤或密度梯度离心法获得大小均一的胚性细胞团，转移到无生长素的培养基上培养p重复几次过滤、培养、再过滤，90%的胚状体能同步发育，达到成熟阶段p该方法较实用、快速，是同步化控制中最常使用的手段上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p采用不同目数的滤网收集体细胞胚，如对云南大叶茶体细胞胚进行筛选p620目之间可收集到较大的子叶分化期体细胞胚p20-40目为长梨形或鱼雷形胚p4070目为心形和球形胚p7o100目为球形胚p100150目为多细胞团块上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 网孔目数指的是每平方厘米

19、(cm2)丝网所具有的网孔数目p将心形胚、鱼雷形胚及鱼雷形偏后期胚转入液体生长培养基中进行培养，50 d内就发育成熟p而球形胚需再转入分化培养基中进一步分化p100150目的多细胞团块则不能在液体生长培养基中分化上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3.在悬浮培养中控制通气p在烟草的组织培养中，乙烯的产生与细胞生长有密切的关系p在细胞生长达到高峰前有一个乙烯合成高峰p可通过乙烯来控制p每隔10或20h通入乙烯到培养基中（3-4s）上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4.利用渗透压控制p不同发育阶段的体胚具有不同的渗透压n球形胚：17.5%n心形胚：12.5%n鱼雷形胚：8.5%n成熟胚：0.5%p通过改

20、变培养基的渗透压使其停留于某一阶段，然后通过降低蔗糖浓度，是胚状体进入同步发育的状态上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 四、人工种子的包裹四、人工种子的包裹上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 1人工种子的基本要求p 要有健壮的具有高转换率的体胚p 对包裹材料的要求n对体胚无损伤、无毒性n经得起在储藏、运输和种植过程中的一般操作p 人工种子中应含有易释放的养分和发育调节剂p 价廉物美、适合农业机械化播种上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p用于生产人工种子的植物n具有坚实组培工艺基础的作物（已具备能生产高质量体胚的实验体系）n苜蓿、胡萝卜、香菜等n 具有强大商业基础及工艺基础的作物n芹菜、莴苣、番茄、玉米等

21、n一般来讲，农业、林业及园艺上大面积推广的优良作物品系、优质蔬菜、名贵药材等都可作为对象上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 2 人工胚乳p在自然种子中，作为合子胚发育而存在的营养仓库胚乳p人工胚乳的目的也是要通过各种必需物质的组合为体胚创造出一个微小的含有胶质的营养成份环境，为体胚转换时提供物质营养上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 糖类p既可以作为繁殖体生长的碳源物质，叉可以改变包被体系中的渗透势，防止营养成分外泄，还能在人工种子低温储藏过程中起保护作用p目前用于人工胚乳中的糖类主要有蔗糖、麦芽糖、果糖和淀粉等p其中以蔗糖应用最为广泛，促进人工种子转化成苗的效果也相对较好上海海洋大学 细胞工程 黄林

22、彬 p叶志毅等(2001)制作桑树(Morus alaba)体细胞胚人工种子时发现，与果糖相比，蔗糖更利于人工种子的发芽和生长p不同蔗糖浓度对人工种子萌发的影响也不同nAdriani等(2000)对猕猴桃(Actinidia deliciosa)不定芽的包被过程中，发现增加蔗糖的浓度可增加其转化率p但也有研究表明蔗糖的作用不及麦芽糖好上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 淀粉p淀粉在人工种子包被中应用也比较广泛p淀粉可以在胶囊中分解，为植物繁殖体的发育提供碳源支持 pRedenbaugh等(1987)在制作苜蓿体细胞胚人工种子时发现，马铃薯淀粉能代替麦芽糖，使体胚转化率达35.4%上海海洋大学 细胞

23、工程 黄林彬 p黄绍兴等(1995)对木薯淀粉研究还发现p淀粉分子多孔状的结构可以改变海藻酸钙胶囊的致密结构，从而增加胶囊的透气性、保水性和吸水性，提高了人工种子的萌发率p在实际操作中，几种碳源成份配合使用也可以达到很好的效果上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 植物生长调节物质p在人工胚乳中加入BA、IAA、GA3、NAA、ABA等植物生长调节物质p可以促进体细胞胚胚根、胚芽的分化与生长，还可以促进非体细胞胚繁殖体转化成苗上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 pAntonietta等(1998)包被茶枝柑(Citrus reticulata)的体细胞胚人工种子，发现在人工胚乳中附加GA3能够使其萌发率由

24、26.7%提高到50%上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p在半夏(Pinellia ternata)小块茎人工种子中添加GA3和NAA可使其较易生根，成活率提高pSaiprasad等(2003)包被兰属(Orchid)植物球茎体，附加BA（0.44 mol/L，人工合成的细胞分裂素）和NAA（0.54 mol/L），可使其转化成苗率达100%上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 金属离子pCa2+可以作为很好的海藻酸钠的离子交换剂，用于人工种子包被中，对繁殖体的萌发与转化不造成影响上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 藻酸盐的水凝胶胶囊系统p在海藻酸钠溶液中加入MS或White等培养基的大量元素、微量元素、

25、有机物质等基本成分，将它们混合制成胶囊丸p为了促进体胚的生长，在人工胚乳中也加入促进胚根、胚芽生长的植物激素或有益微生物、杀虫剂、除草剂等农用化学药品，人为影响植物的抗逆性上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3 包裹材料的选择p包裹后胶囊硬度较为合适，且对体胚发育无明显不利影响的凝胶p海藻酸钠：普遍采用，从海藻中提取的多糖高分子化合物n优点：使用方便、无毒性、价格低廉和具有一定的强度n缺点：“易漏”，水溶性养分容易渗漏，易干上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 涂抹其它材料形成外包膜n1987年，发现疏水性物质Elvax-4260（乙烯、乙烯基乙配和丙烯酸共聚物）能在一定程度上减少人工种子之间的粘连，并

26、明显减轻蒸发失水，涂抹后的苜蓿人工种子仍可正常发芽n1990年，半疏水性膜操作简便，且能够减少蒸发，对促进胡萝卜种子在土壤的萌发有一定作用，而亲水性外膜无明显效果上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 解决 办法-1p1993年，利用脱乙烯壳聚糖涂抹海藻酸钠包被的油菜体细胞胚，发芽率达100%p1994年，以15%丙烯酸树脂溶液成膜10 min制作的外膜涂抹水稻人工种子效果较佳p1996年，石蜡能够有效地被烘干并具有一定的对氧的渗透性，用0.4 mm的石蜡涂抹包被的细胞团，在空气中（25）储存60 d仍可达到90%的转化率上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p在海藻酸钠胶囊外面再包被一层海藻酸钠的方法也能

27、达到与其他涂膜相同的效果n在包被苹果顶芽时，采用两层包被的方法，较一层包被的转化率（40）相比可提高到70上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 添加助剂p添加纤维素衍生物、活性炭和高分子化合物等n1990年，在胡萝卜人工种子的研究中加入在MS培养基中浸泡过的活性炭，可以有效地减少营养成分的泄漏n1995年，在安祖花人工种子中加入0.1%的活性炭，不仅有效控制了营养物质的散失，也使其黄褐化率降低，萌发率和转化率提高上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 解决 办法-2p在水稻人工种子中添加聚乙烯吡咯啉酮和聚乙烯醇高分子聚合物，形成的颗粒粘连少、较分散，且不易失水变形p在海藻酸钠中加入多糖、树胶、高岭土可减慢凝

28、胶脱水速度，并提高了干化胡萝卜体细胞胚的活力上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p两种措施结合使用，可以更好地解决海藻酸钙胶囊的缺陷p1995 年，在安祖花人工种子胚乳中加入活性炭并用酯类共聚物涂抹使安祖花人工种子在有菌条件下的转化率可达71.4%，较只加活性炭（42.5%）的情况要高上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 解决 办法-3人工种皮软化p另外，海藻酸钠包被的人工种子经低温储藏后，易在表面形成坚硬的外壳而妨碍了人工种子的萌发pKNO3 可用作海藻酸钠包被人工种子的软化剂，K+置换海藻酸钙中的Ca2+以达到软化的效果p2001年，Guerra等用100 mol/L KNO3的处理菲约果的人工种子

29、，与用蒸馏水处理的相比提高81.2%上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 五、五、人工种子的人工种子的储存和萌发储存和萌发上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 贮藏p因农业生产的季节性所限，需要人工种子能贮藏一定时间p但人工种子含水量大，常温下易萌发，易失水干缩，贮藏难度较大p人工种子研究中的主要难点之一上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p人工种子的储藏技术很大程度上依赖于包被技术，不同的包被材料的储藏方法也不同p以海藻酸钠为包被材料制作的人工种子为例，介绍人工种子的储藏技术上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 1.低温储藏技术低温储藏技术p在不伤害植物繁殖体的前提下，通过降低温度来降低繁殖体的呼吸作用，使之进入

30、休眠状态p常用的温度一般是4 p储藏时间可达1-2个月上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p泡桐的人工种子p4 保存上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 储藏藏时间 d体胚体胚 存活率存活率%体胚体胚 萌萌发率率%3067.843.26053.532.4非体细胞胚人工种子可以在4下储藏更长的时间p1999年，包被濒危植物地宝兰的类原球体，储藏120 d后生存能力与储藏前相比无明显变化p马铃薯芽尖用海藻酸钠包被，储藏270 d、360 d和390 d后 萌发率分别是100%、70.8%和25%上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p随着低温储存时间的加长，包被体系内的含氧量降低，人工种子萌发率会下降上海海洋大学

31、 细胞工程 黄林彬 2.液体石蜡储藏技术液体石蜡储藏技术p液体石蜡作为经济、无毒稳定的液体物质，常被用来储藏细菌、真菌和植物愈伤组织p研究胡萝卜人工种子的结果表明n短时间保存（1个月）能较正常的生长n长时间（79 d），则人工种子苗的生长则明显比对照组差p并发现液体石蜡对幼苗的呼吸和光合作用有一定的阻碍作用，达不到所需的效果上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 3.超低温储藏技术超低温储藏技术p超低温一般是指-80 以下的低温n超低温冰箱（-80-150 ）n液氮（-196 ）p在此温度下，植物活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止p所以，植物繁殖体在超低温过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失

32、形态发生的潜能上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p目前应用于人工种子超低温保存的方法主要是预培养-干燥法n即人工种子经一定的预处理，并进行干燥，然后浸入液氮保存p经液氮储藏后，可直接在室温下自然解冻上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p1999年，将蛇麻草离体培养获得的芽尖干燥脱水，经液氮储藏后，室温下解冻5 min，恢复率可达80，且无表型变异现象上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 4.植物激素在储存中的作用p脱落酸(ABA)是一种植物逆境激素，可以诱导产生蛋白质、多胺、脯氨酸和淀粉等物质的增加，使体细胞胚在干燥处理中受到保护上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 pNieves等(2001)对甘蔗晚盾片期胚

33、用ABA或JA（茉莉酸）处理后进行包被，并在干燥器中用无水硅酸进行干燥处理，使其水含量降至60或30。p结果发现存活的体细胞胚是由ABA处理的胚，而用JA处理不能达到此效果上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 抑制植物生长、萌发、促进衰老、提高抗性等生理作.p对于非体细胞胚人工种子，Khor 等(1998)对龙舌兰(Spathoglottis plicata)原球茎用l0-5 M 的ABA处理，经干燥脱水与包埋，也可获得极高的存活率。上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p高渗透压处理可增加植物繁殖体内源ABA浓度、诱导休眠，从而增加其耐旱性上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 渗透渗透压对高高丽参体胚休眠的影

34、响参体胚休眠的影响蔗糖浓度 （%）能否萌发ABA浓度（ng/g FW）3%能258.49%否487.8p榆叶梧桐(Guazuma crinita)的不定芽经25%的甘油，15%蔗糖，15%的乙烯基乙二醇，13%的二甲基亚砜和2%的聚乙二醇(4 000)溶液(w/v)在25处理15-60min后储存在液氮中，可得到80%的存活率上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 防腐p人工种子大面积田间应用的关键技术之一n人工胚乳中含有糖类等有机物质n目前尚未得到可真正称为人工种皮的包裹材料p暴露于田间的开放系统中，势必会受微生物的侵染而腐烂p在人工种皮中添加一定量的抗生素或防腐剂等能起抑菌作用，萌发率可提高 4-10%上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 人工种子技术展望及存在的人工种子技术展望及存在的 问题问题上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p目前，科学工作者已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用还有很大距离上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 p主要有三大难题有待克服n许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚n现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀n人工种子的贮藏有待进一步完善 上海海洋大学 细胞工程 黄林彬