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1、任务九 金免疫标记技术知识目标技能目标素质目标1.1.掌握金免疫标记技术原理和分类掌握金免疫标记技术原理和分类2.2.了解标记物的制备了解标记物的制备3.3.了解金免疫检测的临床应用了解金免疫检测的临床应用 1.1.会金免疫标记物的制备操作会金免疫标记物的制备操作2.2.会熟练操作金免疫检测过程会熟练操作金免疫检测过程 树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。具有良好的职业素质和崇高的职业道德。任务目标任务目标任务对象任务对象肺炎支原体抗体检测肺炎支原体抗体检测 任务过程任务过程 复习提问复习提问 案例导入案例
2、导入 讲解与示教讲解与示教学生操作学生操作讨论分析讨论分析 评价、考核评价、考核 课后思考题课后思考题 教教学学环环节节2 30 2 10 40 5 1 患儿，女，患儿，女，患儿，女，患儿，女，11111111岁，间断发热岁，间断发热岁，间断发热岁，间断发热1 1 1 1周，伴咳嗽周，伴咳嗽周，伴咳嗽周，伴咳嗽3 3 3 3天。体温最高天。体温最高天。体温最高天。体温最高39393939。1 1 1 1度，病程第度，病程第度，病程第度，病程第2 2 2 2天查血常天查血常天查血常天查血常规正常，诊断规正常，诊断规正常，诊断规正常，诊断“呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染”并静滴并静滴并静
3、滴并静滴“阿阿阿阿奇霉素奇霉素奇霉素奇霉素”3 3 3 3天，无明显改变，即而出现咳天，无明显改变，即而出现咳天，无明显改变，即而出现咳天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？
4、所致？所致？所致？如何快速诊断？如何快速诊断？如何快速诊断？如何快速诊断？案例导入案例导入 斑点金免疫层析法演示斑点金免疫层析法演示斑点金免疫层析法演示斑点金免疫层析法演示 肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教讲解与示教 二二二二用用用用采采采采血血血血针针针针采采采采指指指指尖尖尖尖血血血血 一一一一洗洗洗洗净净净净双双双双手手手手四四四四立立立立即即即即加加加加1 1 1 1-2 2 2 2滴滴滴滴缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液 三三三三将将将将1 1 1 1滴滴滴滴指指指指尖尖尖尖血血血血滴滴滴滴入入入入加加加加样样样样孔孔孔孔操作操作步骤
5、步骤步骤步骤5 5：1515分钟读分钟读分钟读分钟读取结果取结果取结果取结果？结果？结果？结果？结果？结果？结果？结果？结果老师纠正老师纠正老师纠正老师纠正点评点评点评点评 学生操作学生操作一位学生一位学生一位学生一位学生操作演示操作演示操作演示操作演示学生分组学生分组学生分组学生分组再操作再操作再操作再操作讨论分析讨论分析提出问题提出问题为什么在小小的为什么在小小的试纸条上出现两条试纸条上出现两条红线就是阳性结果红线就是阳性结果，如此简单、方便，如此简单、方便的方法可靠吗？的方法可靠吗？有假阳性或假有假阳性或假阴性的可能吗？阴性的可能吗？如何检测出来如何检测出来的，原理是什么？的，原理是什么
6、？胶体金标记技术胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique)是以胶体金作为示是以胶体金作为示踪标记物，应用于踪标记物，应用于抗原抗体反应的一抗原抗体反应的一种新型免疫标记技种新型免疫标记技术。术。讨论分析讨论分析胶胶体体金金标标记记技技术术讨论分析讨论分析（一）（一）（一）（一）金免疫检测原理金免疫检测原理胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（HAuCl4HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，
7、并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电
8、结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。白质的生物特性。白质的生物特性。白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如结合，如结合，如结合，如SPASPA、PHAPHA、ConAConA等。根据胶体金的一些物理等。根据胶体金的一些物理等。根据胶体金的一些物
9、理等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。讨论分
10、析讨论分析GeobeganGeobeganGeobeganGeobegan等将等将等将等将胶体金标记抗胶体金标记抗胶体金标记抗胶体金标记抗体用于普通光体用于普通光体用于普通光体用于普通光镜下检测镜下检测镜下检测镜下检测B B B B淋淋淋淋巴细脑表面膜巴细脑表面膜巴细脑表面膜巴细脑表面膜免疫球蛋白，免疫球蛋白，免疫球蛋白，免疫球蛋白，建立了光镜水建立了光镜水建立了光镜水建立了光镜水平的免疫金染平的免疫金染平的免疫金染平的免疫金染色。色。色。色。FaulkFaulk和和和和TaylorTaylor首首首首创胶体金标创胶体金标创胶体金标创胶体金标记免疫电镜记免疫电镜记免疫电镜记免疫电镜技术技术技术
11、技术胶体金标记技术胶体金标记技术胶体金标记技术胶体金标记技术进一步发展应用进一步发展应用进一步发展应用进一步发展应用于免疫转印、流于免疫转印、流于免疫转印、流于免疫转印、流式细胞术、液相式细胞术、液相式细胞术、液相式细胞术、液相免疫测定、固相免疫测定、固相免疫测定、固相免疫测定、固相斑点金银染色斑点金银染色斑点金银染色斑点金银染色及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗滤测定法等多种滤测定法等多种滤测定法等多种滤测定法等多种标记免疫检测方标记免疫检测方标记免疫检测方标记免疫检测方法法法法19711971年年年年19781978年年年年近年来近年来近年来近年来讨论分析讨论分析讨论
12、分析讨论分析枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法鞣酸鞣酸鞣酸鞣酸枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法根据不同根据不同根据不同根据不同的还原剂的还原剂的还原剂的还原剂可以制备可以制备可以制备可以制备大小不同大小不同大小不同大小不同的胶体金的胶体金的胶体金的胶体金颗粒。常颗粒。常颗粒。常颗粒。常用来制备用来制备用来制备用来制备胶体金颗胶体金颗胶体金颗胶体金颗粒的方法粒的方法粒的方法粒的方法胶体金的制备胶体金的制备胶体金的制备胶体金的制备 1 1 1 1枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法 （1 1 1 1）10nm10nm
13、10nm10nm胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取0.010.010.010.01HAuCl4HAuCl4HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液100ml100ml100ml100ml，加入，加入，加入，加入1 1 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液3ml3ml3ml3ml，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸30min30min30min30min，冷却至，冷却至，冷却至，冷却至4444，溶液呈红色。，溶液呈红色。，溶液呈红色。，溶液呈红色。（2 2 2 2）15nm15nm15nm15nm胶体金颗粒的制备
14、：取胶体金颗粒的制备：取胶体金颗粒的制备：取胶体金颗粒的制备：取0.010.010.010.01HAuCl4HAuCl4HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液100ml100ml100ml100ml，加入，加入，加入，加入1 1 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液2ml2ml2ml2ml，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸15min15min15min15min30min30min30min30min，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml0.
15、1Mol/L K2CO30.5ml0.1Mol/L K2CO30.5ml0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。混匀即可。混匀即可。混匀即可。（3 3 3 3）15nm15nm15nm15nm、18nm18nm18nm18nm20nm20nm20nm20nm、30nm30nm30nm30nm或或或或50nm50nm50nm50nm胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备：取取取取0.010.010.010.01HAuCl4HAuCl4HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液100ml100ml100ml100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入，加热
16、煮沸。根据需要迅速加入，加热煮沸。根据需要迅速加入，加热煮沸。根据需要迅速加入1 1 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液4ml4ml4ml4ml、2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml、1ml1ml1ml1ml或或或或0.75ml0.75ml0.75ml0.75ml，继续煮沸，继续煮沸，继续煮沸，继续煮沸约约约约5min5min5min5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm15nm15nm15nm、1818181
17、820nm20nm20nm20nm、30nm30nm30nm30nm和和和和50nm50nm50nm50nm讨论分析讨论分析2 2鞣酸鞣酸鞣酸鞣酸枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法 AA液：液：液：液：1 1HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液1ml1ml加入加入加入加入79ml79ml双馏水中混匀。双馏水中混匀。双馏水中混匀。双馏水中混匀。BB液：液：液：液：1 1枸橼酸三钠枸橼酸三钠枸橼酸三钠枸橼酸三钠4ml4ml，1 1鞣酸鞣酸鞣酸鞣酸0.7ml0.7ml，0.1Mol/L 0.1Mol/L K2CO3K2CO3液液液液0.2ml0.2ml，混合，加入双
18、馏水至，混合，加入双馏水至，混合，加入双馏水至，混合，加入双馏水至20ml20ml。将将将将AA液、液、液、液、BB液分别加热至液分别加热至液分别加热至液分别加热至6060，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将BB液加入液加入液加入液加入AA液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm5nm。如需。如需。如需。如需
19、要制备其它直径的金颗粒，则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表15-115-1所列的数字所列的数字所列的数字所列的数字调整鞣酸及调整鞣酸及调整鞣酸及调整鞣酸及K2CO3K2CO3的用量的用量的用量的用量 讨论分析讨论分析（1 1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的
20、胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2 2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有
21、试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂试剂试剂试剂经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（0.45m0.45m）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶
22、体金的注意事项 讨论分析讨论分析（3 3）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的pHpH以中性（以中性（以中性（以中性（pH7.2pH7.2）较好。较好。较好。较好。（4 4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。是进口的。是进口的。是进口的。（5 5）氯金酸配成）氯金酸配成）氯金酸配成）氯金酸配成1 1水溶液在水溶液在水溶液在水溶液在4 4可保持数月可保持数月可保持数月可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配
23、制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项 讨论分析讨论分析 缺点缺点金标法金标法 优点优点 v灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术v一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。讨论分析讨论分析自带质控对照自带质控对照自带质控对照自带质控对照简便、经济实用
24、简便、经济实用简便、经济实用简便、经济实用符号显示结果符号显示结果符号显示结果符号显示结果快速：全部检测过程快速：全部检测过程快速：全部检测过程快速：全部检测过程仅需仅需仅需仅需 3-203-203-203-20分钟。分钟。分钟。分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析讨论分析可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验
25、斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验夹心法夹心法夹心法夹心法竞争法竞争法竞争法竞争法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法讨论分析讨论分析分类分类分类分类 双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法G G区：金标特异性区：金标特异性区：金标特异性区：金标特异性抗体抗体抗体抗体(兔型兔型兔型兔型)C C区：羊区：羊区：羊区：羊抗兔抗兔抗兔抗兔IgIgT T区：特异区：特异区：特异区：特异性抗体性抗体性抗体性抗体 吸水纸吸水纸吸水纸吸水纸标本标本标本标本讨论分析讨论分析讨论分析讨论分析竞争法竞争法竞争法竞争法标本标本标本标本GG区：金
26、标特异性抗体区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体(兔型兔型兔型兔型)C C区：羊区：羊区：羊区：羊抗兔抗兔抗兔抗兔IgIgT T区：标准区：标准区：标准区：标准抗原抗原抗原抗原 吸水纸吸水纸吸水纸吸水纸阳性结果阳性结果阳性结果阳性结果讨论分析讨论分析标本标本G G区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体(兔型兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原 吸水纸阴性结果讨论分析讨论分析讨论分析讨论分析 斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（dot immunodot immunogold filtration assay,DIGFAgold
27、 filtration assay,DIGFA）此法原理）此法原理）此法原理）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，
28、在数分钟内即可显出颜色反应。此方反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIVHIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。讨论分析讨论分析以双抗体夹心法以双抗体夹心法以双抗体夹心法以双抗体夹心法HCGHCGHCGHCG为例：标本中为例：标本中为例：标本中为例：标本中HCGHCG
29、HCGHCG与与与与NCNCNCNC膜上抗膜上抗膜上抗膜上抗-HCG-HCG-HCG-HCG结结结结合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗-HCG-HCG-HCG-HCG抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合物（红色）物（红色）物（红色）物（红色）讨论分析讨论分析考核评分表考核评分表考核评分表考核评分表 布置作业布置作业布置作业布置作业 1.1.实验报告实验报告实验报告实验报告评价、考核评价、考核思考题思考题金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测，预习相关内容预习相关内容预习相关内容预习相关内容