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1、1实验二实验二 限制性核酸内切酶消化质粒限制性核酸内切酶消化质粒DNADNA21.1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNADNA的原理与方法。的原理与方法。2.2.了解酶切反应条件。了解酶切反应条件。3 限制性核酸内切酶是一类能识别双链限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNADNA中某特定中某特定核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNADNA的核的核酸内切酶。酸内切酶。在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能在特定的切割位点裂解在特定的切割位点裂解DNADNA分子中的磷酸二酯键而将
2、双分子中的磷酸二酯键而将双链链DNADNA分子断开。分子断开。4 类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生产生平末端的平末端的DNADNA片段片段(如如Sma:5-CCCGGG-3)Sma:5-CCCGGG-3)；有的；有的切割位点在对称轴一侧，产生切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（带有单链突出末端（3 3 突突出和出和5 5 突出的单链末端突出的单链末端）的）的DNADNA片段称粘性末端片段称粘性末端，如，如EcoR、Hind 切割识别序列后产生两个互补的粘性末切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。端。5EcoR 5-G5-G
3、AATTC-3 5-G AATTC-3 AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5G-5 3-CTTAA G-5+Hind 5-A5-AAGCTT-3 5-A AGCTT-3 AGCTT-3 5-A AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA-5 3-TTCGA A-5A-5 3-TTCGA A-5+6 质粒是细菌细质粒是细菌细胞内独立于染色胞内独立于染色体之外能自主复体之外能自主复制的双链环状制的双链环状DNADNA分子。本实验用分子。本实验用到的是到的是pGEM-T pGEM-T EasyEasy质粒。质粒。7 凝胶电泳不仅可
4、以分离不同相对分子质量的凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNADNA，也可以也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。质粒有质粒有3 3种构型：种构型：1 1、超螺旋的共价闭合环状质粒、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA DNA；2 2、开环质粒、开环质粒DNADNA，即共价闭合环状质粒，即共价闭合环状质粒DNA 1DNA 1条链断裂；条链断裂；3 3、线状质粒、线状质粒DNA DNA，即共价闭合环状质粒，即共价闭合环状质粒DNA 2DNA 2条链发生断裂。条链发生断裂。这这3 3种构型的质粒种构型的质粒DNADNA分子在凝胶电泳中的迁
5、移率不同分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳因此电泳后呈后呈3 3条带。超螺旋质粒条带。超螺旋质粒DNADNA泳动最快，其次为线状泳动最快，其次为线状DNADNA和开环质和开环质粒粒DNADNA。8 EcoR或或Hind可以将可以将pGEM-T Easy质粒质粒DNADNA切开成为线性切开成为线性DNADNA。用未。用未经酶切的经酶切的pUCpUC质粒质粒DNADNA为对照，通过电为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以推测酶切是泳迁移率的比较，就可以推测酶切是否成功。否成功。_+Marker 1 2图片说明：图片说明：1 1 未经酶切的质粒未经酶切的质粒DNADNA2 2 经经EcoREcoR
6、或或HindHind酶切后的线性酶切后的线性DNADNA和目的和目的DNADNA3000bp2000bp1000bp600bp500bp目的目的DNA9主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪主要试剂：限制性核酸内切酶（主要试剂：限制性核酸内切酶（EcoEcoRR、HindHind ）10 10酶切缓冲液酶切缓冲液 琼脂糖琼脂糖 上样缓冲液上样缓冲液 0.5TBE 0.5TBE缓冲液缓冲液 质粒质粒DNADNA 101.1.建立反应体系：建立反应体系：0.5mL0.5mL无菌的无菌的EPEP管管(总体积总体积2020L)L)2.372.37，水浴
7、，水浴1h1h。3.3.低速短暂离心低速短暂离心。4.4.加加4 4LL上样缓冲液于离心管中混匀，上样缓冲液于离心管中混匀，1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（100V,40min100V,40min）。）。(取取1212LL点样点样)无菌双蒸水无菌双蒸水 12 12LL 质粒质粒 2 2LL 1010bufferbuffer酶切缓冲液酶切缓冲液 2 2LL内切酶内切酶 EcoEcoR R 4 4LL轻轻混匀，低速轻轻混匀，低速短暂离心短暂离心11质粒酶切电泳图质粒酶切电泳图121 1、操作时注意：、操作时注意：（1 1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。）分子生物学实验多为微
8、量操作，注意吸样量的准确性。（2 2）要求在冰上操作，并充分混匀。要求在冰上操作，并充分混匀。要求在冰上操作，并充分混匀。要求在冰上操作，并充分混匀。（3 3）打开）打开EPEP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。（4 4）水浴时，将）水浴时，将EPEP管盖严，以防水进入管内。管盖严，以防水进入管内。132.2.内切酶的使用时注意内切酶的使用时注意：(1)(1)不使其污染与浪费；不使其污染与浪费；(2)(2)注意加样顺序；注意加样顺序；(3)(3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/101/10，避免星活，
9、避免星活性（性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高高pHpH（8.08.0）、含有有机溶剂、非）、含有有机溶剂、非MgMg2+2+的二价离子存在）的二价离子存在）。143.3.质粒质粒DNADNA对结果的影响对结果的影响：作为内切酶底物，作为内切酶底物，DNADNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、酚、氯仿、乙醚、SDSSDS、EDTAEDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。在均不同程度影响限制性内切酶的活
10、力。这种抑制作用可通过下列方式克服：这种抑制作用可通过下列方式克服：（1 1）增加酶作用单位数（）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA10-20U/ug DNA）、）、（2 2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂）增大反应体积以稀释可能的抑制剂（3 3）延长反应时间）延长反应时间154 4、反应缓冲液的影响、反应缓冲液的影响反应缓冲液主要由反应缓冲液主要由TrisHClTrisHCl、NaClNaCl、Mg2+Mg2+组成，组成，其中其中Mg2+Mg2+为内切酶辅基；为内切酶辅基；TrisHClTrisHCl维持反应体系维持反应体系pHpH值在之间；值在之间；NaClNaCl浓度不同形成种
11、级别的离子强度：浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（低盐（10mM NaCl)10mM NaCl)中盐（中盐（50mM NaCl50mM NaCl）高盐（高盐（100mM NaCl100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。165、酶切消化反应的温度：酶切消化反应的温度：DNA DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是3737，少
12、数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于3737。176、酶切消化反应的时间：酶切消化反应的时间：反应时间根据酶的单位与反应时间根据酶的单位与DNADNA用量之比来定，原则用量之比来定，原则是是DNA:DNA:酶酶=-:。本实验本实验1 1小时即可充分酶解。小时即可充分酶解。187 7、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法：、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法：（1 1）采用）采用6565条件下温浴条件下温浴20min20min，通过加热失活内切酶；，通过加热失活内切酶；（2 2）加终止反应液（如）加终止反应液（如0.5 mol/L0.5 mol/L的的EDTAEDTA使之在溶液中的终使之在溶液中的终浓度达到浓度达到10 mmol/L10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子）螯合内切酶的辅助因子Mg2+Mg2+使内切酶使内切酶变性以终止反应变性以终止反应.19谢谢谢谢各各位位