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1、o微生物无菌操作技术微生物无菌操作技术o接种技术接种技术o工业生产中的微生物接种工业生产中的微生物接种第四章第四章 微生物无菌操作及接种技术微生物无菌操作及接种技术一、一、微生物无菌操作技术微生物无菌操作技术无菌操作无菌操作目的：目的：n 保证待检物品不被环境中微生物污染；保证待检物品不被环境中微生物污染；n 防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。无菌操作技术：无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
2、1 1接种针接种针 2.2.接种环接种环 3.3.接种钩接种钩 4.5.4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.6.接种圈接种圈 7.7.接种锄接种锄 8.8.小解剖刀小解剖刀一、一、微生物无菌操作技术微生物无菌操作技术无菌操作材料无菌操作材料：n n接种工具接种工具接种工具接种工具一、一、微生物无菌操作技术微生物无菌操作技术无菌操作材料无菌操作材料：n材料材料o器械和用品：酒精灯、记号笔、标签、火柴、灭菌培器械和用品：酒精灯、记号笔、标签、火柴、灭菌培养皿、无菌水、试管架养皿、无菌水、试管架o菌种菌种o培养基：培养基：二、原理：二、原理：o无菌技术：无菌技术：指在微生物实验工作中，指在微生物实验工作中
3、，控制或防止各类微生物的污染及其干控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。扰的一系列操作方法和有关措施。o接种：接种：将微生物接到适于它生长繁殖将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过的人工培养基上或活的生物体内的过程。程。微生物无菌操作技术与接种技术微生物无菌操作技术与接种技术o接种的准备工作接种的准备工作n无菌环境的要求与保持无菌环境的要求与保持n进入无菌室前的准备进入无菌室前的准备n无菌操作的要求无菌操作的要求o接种的操作方法接种的操作方法二、二、微生物接种技术微生物接种技术无菌环境无菌环境无菌室无菌室超净工作台超净工作台无菌环境的要求与保持无菌环
4、境的要求与保持（一）接种的准备工作（一）接种的准备工作（1）无菌室的结构：）无菌室的结构：o应有更衣间、缓冲间、应有更衣间、缓冲间、操作间操作间o应有良好的通风条件，应有良好的通风条件，安装空调设备及过滤设安装空调设备及过滤设备备无菌环境的要求与保持无菌环境的要求与保持1 1、无菌室、无菌室无菌室的结构无菌室的结构（2）无菌室的消毒和防污染）无菌室的消毒和防污染o无菌室内空气测试应基本达到无菌。无菌室内空气测试应基本达到无菌。o每日（使用前）紫外线照射（每日（使用前）紫外线照射（12小时）小时）.o每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）小时）.o每月用新洁尔灭
5、擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。o定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖动态。动态。无菌环境的要求与保持无菌环境的要求与保持2 2、超净工作台、超净工作台 超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程度的保护以防污染并保护操作者。度的保护以防污染并保护操作者。原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空原理：超净工作台的
6、洁净环境是在特定的空间内，洁净空气气(进滤空气进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。无菌环境的要求与保持无菌环境的要求与保持垂直流超净工作台 水平流超净工作台水平流超净工作台 垂直流超净工作台垂直流超净工作台 超净台的使用与维护超净台的使用与维护o风速保持在米风速保持在米/秒秒o使用前打开紫外灯照射使用前打开紫外灯照射4060mino开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或的酒精或0
7、.5%过氧乙过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。酸喷洒擦拭消毒工作台面。o使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；o请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；o使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；o使用完毕后，使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射射15min.o定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。无菌环境的要求与
8、保持无菌环境的要求与保持3 3、无菌器材准备、无菌器材准备o灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.o消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台等工作台等无菌环境的要求与保持无菌环境的要求与保持（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）用紫外线灭菌处理）用紫外线灭菌处理3060min；（3）检查无菌器材是否完备；）检查无菌器材是否完备；（4）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75酒酒精棉球将手擦干净。精棉球
9、将手擦干净。（5）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、鞋。鞋。进入无菌室前的准备进入无菌室前的准备（1 1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2 2）使用玻璃器皿应轻取轻放。）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3 3）在火焰上方操作；）在火焰上方操作；（4 4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5 5）在接种培养物时，协作应轻、准）在接种培养物时，协作应轻、准。（6 6）不能用嘴直接吸吹吸管。）不能用嘴直接吸吹吸管。（7 7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于
10、盛有）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%5%来苏尔溶液的来苏尔溶液的消毒桶内消毒。消毒桶内消毒。无菌操作要求无菌操作要求无菌操作要求无菌操作要求无菌操作要求无菌操作要求n接种的基本程序接种的基本程序n常用接种方法常用接种方法o斜面接种斜面接种o划线接种划线接种o液体接种液体接种o穿刺接种穿刺接种（二）接种的操作方法（二）接种的操作方法1 1、接种的基本程序、接种的基本程序灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境操作需在
11、无菌室或超净工作台内进行操作需在无菌室或超净工作台内进行无菌室、超净工作台使用前后需进行无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。消毒。实验使用的物品使用前后需严格灭菌实验使用的物品使用前后需严格灭菌（二）接种的操作方法（二）接种的操作方法2 2、常用的接种方法、常用的接种方法斜面接种斜面接种划线接种划线接种液体接种液体接种穿刺接种穿刺接种（二）接种的操作方法（二）接种的操作方法 斜面接种：斜面接种：从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。斜面培养基上的接种方法。用于用于好气性微生物好气性微生物的接种。的接种。2 2、
12、常用的接种方法、常用的接种方法1)标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名2)点燃酒精灯。点燃酒精灯。3)接种：接种：（1）手持试管）手持试管 将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平尽量放平。（2）旋松管塞）旋松管塞（3）接种环灼烧灭菌接种环灼烧灭菌 斜面接种斜面接种 斜面接种斜面接种3）接种：接种：（4）拔管塞：拔管塞：用右手的无用右手的无名指、小指和手掌边先后名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的取下
13、菌种管和待接试管的管塞，让试管口缓缓过火管塞，让试管口缓缓过火灭菌灭菌(切勿烧得过烫切勿烧得过烫)斜面接种斜面接种3）接种：接种：（5）取菌）取菌:接种环冷却，轻接种环冷却，轻沾取少量菌体或胞子，沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环管，注意不要使接种环碰到管壁，取出后带菌碰到管壁，取出后带菌接种环不可通过火焰。接种环不可通过火焰。斜面接种斜面接种3）接种：接种：（6）接种）接种:n 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从斜面培养基底部向上作斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培形来
14、回密集划线，勿划破培养基。养基。n 有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。斜面接种斜面接种3）接种：接种：(7)塞管塞：塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。空气。(8)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。斜面接种示意图斜面接种示意图由斜面菌
15、接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作方法：操作方法：与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉塞再轻轻摇匀。塞再轻轻摇匀。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种接种2 2、常用的接种方法、常用的接种方法 液体接种液体接种2 2、常用的接种方法、常用的接种方法划线划线接种接种目的：使混合的细菌呈单个分散生
16、长，形成单个菌落，以便获得目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、活菌计数。纯菌、活菌计数。方法：方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本分区划线法：适用于含菌量较多的标本 连续划线法：适用于含菌量较少的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本2 2、常用的接种方法、常用的接种方法划线划线接种接种分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环2 2、常用的接种方法、常用的接种方法划线划线接种接种连续划线法连续划线法2 2、常用的接种方法、常用的接种方法划线划线接种接种用接种针从菌种
17、斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。深层培养基中的接种方法。用于用于厌气性厌气性细菌培养、检查细菌的细菌培养、检查细菌的运动能力、运动能力、保藏菌种保藏菌种。只适宜于细菌和酵母的接种培养只适宜于细菌和酵母的接种培养2 2、常用的接种方法、常用的接种方法穿刺穿刺接种接种穿刺接种方法：穿刺接种方法：1)标记标记 2)点燃酒精灯点燃酒精灯 3）接种）接种 （1）手持试管）手持试管 （2）旋松棉塞旋松棉塞 （3）接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼
18、烧灭菌灼烧灭菌 2 2、常用的接种方法、常用的接种方法穿刺穿刺接种接种3）接种）接种（4 4）拔出棉塞）拔出棉塞（5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种（6）穿刺：将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入培养）穿刺：将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入培养基，至接近试管底部，然后沿接种线拔出基，至接近试管底部，然后沿接种线拔出（7）塞上棉塞）塞上棉塞（8）接种针灼烧灭菌）接种针灼烧灭菌2 2、常用的接种方法、常用的接种方法穿刺穿刺接种接种1 1、什么是无菌技术？、什么是无菌技术？2 2、如何做好无菌室的消毒和防污染工作？、如何做好无菌室的消毒和防污染工作
19、？3 3、如何做好超净台的使用与保养？、如何做好超净台的使用与保养？4 4、无菌操作的目的是什么？、无菌操作的目的是什么？5 5、进入无菌室前要做好哪些准备工作？、进入无菌室前要做好哪些准备工作？6 6、验操作过程的无菌操作要求包括哪些内容？、验操作过程的无菌操作要求包括哪些内容？7 7、接种时，为何要尽量使试管平放？接种时，为何要尽量使试管平放？8 8、穿刺接种时能否将接种针直接穿透培养基？、穿刺接种时能否将接种针直接穿透培养基？问题和讨论问题和讨论 工业生产中培养的菌种接入种子罐时，一般先制成菌悬液。工业生产中培养的菌种接入种子罐时，一般先制成菌悬液。常用的方法有压差法、火焰封口法等。常用
20、的方法有压差法、火焰封口法等。1、火焰封口法、火焰封口法 种子罐的接种口周围设有沟槽，接种时先在沟槽里注入少种子罐的接种口周围设有沟槽，接种时先在沟槽里注入少量酒精，然后用火焰点燃酒精，使接种口被包围在一堆火量酒精，然后用火焰点燃酒精，使接种口被包围在一堆火焰之中，接着将菌悬液倒入种子罐中即可。焰之中，接着将菌悬液倒入种子罐中即可。工业生产中的微生物接种工业生产中的微生物接种2、压差法、压差法 先用棉花球蘸消毒剂覆盖在种子罐接种口的橡皮塞上，消毒先用棉花球蘸消毒剂覆盖在种子罐接种口的橡皮塞上，消毒5 10min，将连接在盛有菌悬液的容器上的接种针头迅速插，将连接在盛有菌悬液的容器上的接种针头迅速插入接种口的橡皮小孔中，然后平衡种子罐与盛菌悬液的容器入接种口的橡皮小孔中，然后平衡种子罐与盛菌悬液的容器之间的压力，接着降低种子罐的压力，菌悬液就会注入到种之间的压力，接着降低种子罐的压力，菌悬液就会注入到种子罐里。接种完后，再用消毒剂拭净接种口的小孔。子罐里。接种完后，再用消毒剂拭净接种口的小孔。工业生产中的微生物接种工业生产中的微生物接种