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1、课后思考1、简述发酵工程与生物技术和生物工程其他学科的区别与联系？2、查阅文献，结合科学发展和国家需要，讨论发酵工业的发展前景？主要参考书：主要参考书：发酵工艺原理发酵工艺原理中国医药科技出版社中国医药科技出版社新编生物工艺学新编生物工艺学 华东化工大学出版社华东化工大学出版社生物化学工程生物化学工程上海科学技术出版社上海科学技术出版社微生物工程工艺原理微生物工程工艺原理华南理工大学出版社华南理工大学出版社 现代生物技术概论现代生物技术概论北京师范大学出版社北京师范大学出版社 微生物工程微生物工程科学出版社科学出版社 发酵工业概论发酵工业概论中国轻工业出版社中国轻工业出版社 主要专业期刊主要专
2、业期刊微生物学报微生物学报 微生物学通报微生物学通报食品与发酵工业食品与发酵工业 工业微生物工业微生物生物工程学报生物工程学报 生物工程进展生物工程进展食品与生物技术食品与生物技术 生物技术通报生物技术通报医药生物技术医药生物技术专业站点专业站点生物引擎：www.bio-美国化学网数据库群： 欧洲专利条约组织： 中国数字图书馆：http:/202.206.73.85/第二章第二章 发酵工业菌种发酵工业菌种一、工业微生物菌种的来源一、工业微生物菌种的来源二、工业微生物工业应用二、工业微生物工业应用三、发酵工业菌种分离筛选三、发酵工业菌种分离筛选四、发酵工业菌种的鉴定四、发酵工业菌种的鉴定从自然界
3、分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种产 品基因工程基因工程基因工程基因工程诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种生产用菌种生产用菌种生产用菌种生产用菌种扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原原原原 料料料料微生物菌体微生物菌体微生物菌体微生物菌体代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物分离提纯分离提纯分离提纯分离提纯接种接种接种接种培养基配置培养基配置培养基配置培养基配置灭菌灭菌灭菌灭菌一、工业微生物菌种的来源一、工业微生物菌种的来源目前已经知道的微生物约有目前已经知道的微生物约有1010万种，分布在以下各界中：万种，分布在以下各界中：1.原核生物界：
4、例如细菌、蓝藻原核生物界：例如细菌、蓝藻2.真菌界：例如酵母菌真菌界：例如酵母菌3.原生生物界：例如草履虫、变形虫原生生物界：例如草履虫、变形虫4.病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒 微生物每克土壤中的数量细菌9.8107放线菌2.0106真菌1.2105藻菌2.5104原生动物3.0104农田上层15cm处微生物的数量空气清洁度菌落数菌落数最清洁的空气最清洁的空气1-21-2洁净空气洁净空气3030个以下个以下普通空气普通空气30-15030-150轻度污染空气轻度污染空气300以下严重污染空气严重污染空气301301以上以上菌落数与空气清洁度的关系部位含量
5、部位含量眼睛眼睛1g1g肺肺20g20g鼻腔鼻腔10g10g肠道肠道1000g1000g口腔口腔20g20g生殖道生殖道20 g20 g皮肤皮肤200g200g总量1271g1271g人体微生态中微生物的含量回肠结肠直肠或粪便双歧杆菌1041071010拟杆菌1031081010肠杆菌103106106肠球菌107乳杆菌104人体消化系统中微生物群体(个/g)1、细菌A、细菌的结构B、细菌的繁殖 细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖 C、细菌的菌落定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一
6、个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做群落。特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。几种菌落特征 2、放线菌 A、放线菌的形态B、放线菌的结构 C、放线菌的分布放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。D、放线菌的繁殖放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。3、酵母菌A、酵母菌形态 酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细
7、菌的单细胞个体要大得多，一般为（15）（530）微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。酵母菌的细胞形态B、酵母菌菌落 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但 比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落 各种酵母菌的菌落 C、酵母菌的繁殖无性繁殖：芽殖：酵母菌最常见的无性繁殖方式是芽殖。芽殖发生在细胞壁的预定点上，此点被称为芽痕，每个酵母细胞有一至多个芽痕。成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞
8、的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。如果酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。酵母菌的芽殖过程 1泡；2小管；3核；4液泡 酵母菌假菌丝的形成 图中1、2、3、4 是出芽的顺序 裂殖：是少数酵母菌进行的无性繁殖方式，类似于细菌的裂殖。其过程是细胞延长，核分裂为二，细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个具有单核的子细胞。有性繁殖：酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行无性繁殖的。两个临近的酵母细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个通道，两个细胞
9、核在此通道内结合，形成双倍体细胞核，然后进行减数分裂，形成4个或8个细胞核。每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。左图为酵母菌子囊孢子的形成过程 1、2、3、4：两个细胞结合；5：接合子；6、7、8、9：核分裂；10、11：核形成孢子 4、丝状真菌霉菌A、霉菌的形态霉菌的霉菌的菌体菌体由分枝或不分枝的菌丝构成。由分枝或不分枝的菌丝构成。许多分许多分枝菌丝相互交织在一起构成枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体菌丝体。菌丝是中空管状结构，直径约菌丝是中空管状结构，直径约210m。霉菌菌丝类型：霉菌菌丝类型：按形态分无隔菌丝和有隔菌丝：按形态分无隔菌丝和有隔菌丝：无隔
10、菌丝：无隔菌丝：为长管状单细胞，细胞质内含多个核。为长管状单细胞，细胞质内含多个核。其生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多。这是其生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多。这是低等真菌所具有的菌丝类型。低等真菌所具有的菌丝类型。有隔菌丝：有隔菌丝：菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一一段菌丝就是一个细胞，菌丝由个细胞，菌丝由多个细胞组成，每个细胞内有一至多个核。多个细胞组成，每个细胞内有一至多个核。隔膜上有单孔或多孔，细胞质和细胞核可自由流通，每个隔膜上有单孔或多孔，细胞质和细胞核可自由流通，每个细胞功能相同。这是高等真菌所具有的类型。细胞功能相同。这是高等真菌所具有的类
11、型。按分化程度分营养菌丝和气生菌丝按分化程度分营养菌丝和气生菌丝:营养菌丝营养菌丝(基内菌丝基内菌丝)：伸入到培养基内部，以吸收养分为：伸入到培养基内部，以吸收养分为主的菌丝。主的菌丝。气生菌丝：向空中生长的菌丝。气生菌丝发育到一定阶段气生菌丝：向空中生长的菌丝。气生菌丝发育到一定阶段可分化成繁殖菌丝。可分化成繁殖菌丝。B、霉菌的菌落特征菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，有的菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈呈 绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可由于不同的真菌
12、孢子含有不同的色素，所以菌落可呈现红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。呈现红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。液体培养时的特征：液体培养时的特征：如果是静止培养，霉菌往往在表面上生长，液面上形如果是静止培养，霉菌往往在表面上生长，液面上形成成 菌膜。菌膜。如果是震荡培养，菌丝有时相互缠绕在一起形成菌丝如果是震荡培养，菌丝有时相互缠绕在一起形成菌丝球，菌丝球可能均匀地悬浮在培养液中或沉于培养液底球，菌丝球可能均匀地悬浮在培养液中或沉于培养液底部。部。土曲霉的菌落土曲霉的菌落点青霉的菌落点青霉的菌落黑曲霉的菌落黑曲霉的菌落黑根霉的菌落黑根霉的菌落霉菌菌落正反面颜色呈现明显差别，
13、原因是由于气生菌丝分化出来的子实体和孢子的颜色往往比深入到固体基质 内的营养菌丝的颜色深；而菌落中心与边缘颜色、结构不 同的原因是因为越是接近中心的气生菌丝其生理年龄越大，发育分化和成熟的年龄越早，故颜色比菌落边缘尚未分化 的菌丝深，结构更复杂。C、霉菌的繁殖孢囊孢子孢囊孢子曲霉属分生孢子曲霉属分生孢子青霉属分生孢子青霉属分生孢子节孢子节孢子厚垣孢子厚垣孢子5、未培养的微生物定义：定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物。主要是极端微生物类别。比如：高温、低温、高压、高盐度、高辐射等环境。研究方法：研究方法：1）模拟自然培养法；）模拟自然培养法；2）宏基因组分析法。
14、）宏基因组分析法。6、病毒 A、病毒的形态 B、病毒的繁殖吸附吸附吸附吸附释放释放释放释放装配装配装配装配合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质注入核酸注入核酸注入核酸注入核酸二、工业微生物的应用二、工业微生物的应用 初级代谢产物1.定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。2.举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。3.特征：A、不同的微生物初级代谢产物基本相同；B、初级代谢产物合成过程是连续不断的。次级代谢产物1.定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。2.举例：抗
15、生物、毒素、激素、色素等。3.特征：A、不同的微生物初级代谢产物不同；B、抗生素是一类具有特异性抑菌和杀菌作用的有机化合物。微生物代谢的人工控制目的最大限度积累对人类有用的代谢产物 措施改变微生物遗传特性控制生产过程种各种条件实例人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸；人工控制谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸。天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物甲硫氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸高丝氨酸高丝氨酸不能合成可以大可以大量积累量积累赖赖 氨氨 酸酸人工诱变的人工诱变的人工诱
16、变的人工诱变的菌种不能产生菌种不能产生菌种不能产生菌种不能产生天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸黄色短杆菌的代谢过程甲硫氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物中间产物抑制抑制抑制抑制高丝氨酸高丝氨酸高丝氨酸高丝氨酸三、发酵工业菌种分离筛选三、发酵工业菌种分离筛选1、微生物工业对菌种的要求A、培养基原料廉价、迅速生长，目的代谢产物产量高；B、可在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期 较短(一般三天之内)；C、抗噬菌体和杂菌的能力强；D、菌种纯粹,不易变异退化,以保证发酵生产和产品质量的稳定性；E、
17、菌体不是病源菌,不产生任何有害的物质和毒素。2、微生物工业用菌种的总趋势A、菌种 发酵菌氧化菌;野生菌变异菌;自然选育代谢控制育种;从诱发基因突变基因重组的定向育种;适应原料的转换和新产品不断出现的新菌种。B、优良生产菌种的选育手段 自然选育、诱变选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术等。基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展，使菌种选育技术及新产品不断更新。3、工业微生物的来源 A.自然界来源包括土壤，水，有生命的动植物，废水，新鲜的和腐烂的食物，还有蜜饯、酸菜、咸菜等。B.间接来源是菌种保藏单位，还有一些大型的发酵工厂也有其菌种保藏室。C.有的发酵并不需要采用纯的菌种;
18、某些细菌的生长能够排斥其他的微生物，发酵过程不用纯的菌种也能达到纯种生产的目的。4 4、分离思路、分离思路培养分离中要解决的问题:“分离什么和从哪里分离出?”必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。选择适宜的培养分离方法和检测方法。新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。定定方方案案：首先要查阅资料
19、，了解所需菌种的生长培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。增增殖殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。5、新种分离与筛选的步骤菌种筛选主要步骤调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案 确定采集样品的生态环境 采样 确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离分离 原种斜面 确定发酵培养基础条件 筛选 初
20、筛（1株1瓶）复筛（1株35瓶）结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株35瓶）35株 单株纯种分离分离 生产性能试验 毒性试验菌种鉴定 自然界菌种的分离(自然选育)（1）定义:不经人工处理,利用微生物的自发突变进行菌种选育的过程。（2）遗传学理论基础:菌种的自然突变，包括多因素低剂量的诱变效应和碱基对错误配对的互变异构效应。（3）步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。（4）菌种分离的程序：采采 样样 采样对象采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某
21、些水域等。从自然界筛选从自然界筛选采样季节采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采采土土方方式式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。采样的特点：采样的特点：A.采样要综合根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等。如土壤是微生物聚集最丰富的场所，因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。B.遵循的原则是材料的来源越广泛,越有可能获得新的菌种。特别
22、是在一些极端环境中，如高温、高压、高盐、高pH、低pH以及海洋中，存在着大量适应了各种环境压力的微生物类群。C.采样后一般应尽快分离。D.样本的预处理:在分离之前，含微生物材料的标本首先进行预处理，可大大提高菌种分离的效率。增殖培养增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。培养分离培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是
23、处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。划线法划线法 是将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线(有扇形划线法、方格划线法及平行划线法等)，菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。划线法简单且较快。稀释法稀释法 是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。1.稀释平皿分离法稀释平皿分离法10
24、0ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释平皿划线分离法 a.连续划线分离法 b.分区划线分离法筛筛 选选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。生产性能的测定生产性能的测定 纯种分离后得到的菌株数量非常大，一般采用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直至获得1-3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。测定的特性包括:形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品质和产量、耐受最高
25、温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。毒性试验毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。将生态学方法用于培养分离的将生态学方法用于培养分离的一般思路要点一般思路要点1罗列出所要分离的微生物类群；2根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：3将若干样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；4罗列出所要
26、考察和测量的环境参数，如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；5列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；7用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。采样和采集方法采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无
27、菌小塑料袋和塑料瓶等。采样的注意事项采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长生态学参数及培养基生态学参数及培养基的组成原则的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分
28、离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50gm1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。分分 离离目的微生物不纯，需分离分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。透明圈透明圈
29、法：混浊底物被分解后形成透明圈透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。变色圈法：直接用显色剂或指示剂。生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。抑制圈法：琼脂块培养法。用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选检定菌培养，加上发酵液 放线菌的分离培养基的组成原则放线菌的分离培养基的组成原则大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，
30、以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37培养箱中存放3天。放线菌的分离放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。次代培养及纯化次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同
31、的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。放线菌菌落形态真菌分离1、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁徙生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种
32、技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。生产选种生产选种
33、 是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。四、发酵工业菌种的鉴定四、发酵工业菌种的鉴定鉴定方法包括：1）测定一系列必要的鉴定指标；2）查找权威性的鉴定手册，确定菌种类型。四个不同的水平：1）细胞的形态和习性水平；2）细胞组分水平；3）蛋白质水平；4）基因和核酸水平。经典的分类鉴定方法：经典的分类鉴定方法：1）形态学特征：2）生理生化特征；3）血清学试验与噬菌体分型；4）氨基酸顺序和蛋白质分析。现
34、代分类鉴定方法：现代分类鉴定方法：1）、微生物遗传型的鉴定：DNA碱基组成；核酸的分子杂交；遗传重组特性；rRNA序列分析。2）、细胞化学成分特征分类：细胞壁的化学组分及分枝菌酸分析；全细胞水解液及磷脂成分分析；脂肪酸组成和磷脂成分分析；醌类及多胺类的分析；可溶性蛋白的质谱分析。3）、数值分类法：即统计分类法。将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定：将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定：节省时间，结果准确。机构有：1）中国微生物菌种保藏管理委员会；2）中科院典型培养物保藏委员会；3）中国典型培养物保藏中心；4）中国工业微生物菌种保藏管理中心；5）美国典型培养物保藏中心；6）英国国家典型培养物保藏中心；7）法国巴斯德研究所菌种保藏中心；8）德国科赫研究所菌种保藏中心。