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1、2.2动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合技术与单克隆抗体动物细胞融合技术与单克隆抗体本节聚焦1、什么是动物细胞核移植技术？2、动物体细胞核移植的基本过程是什么？3、体细胞核移植技术的应用前景有哪些？4、怎样理性看待体细胞核移植技术存在的问题？植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故而知新 植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？思考思考思考思考实例：1970年，动物细胞融合实验人细胞鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白细胞融合人鼠杂交细胞3
2、7培养40min细胞融合灭活的仙台病毒诱导 如果让动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？思考思考思考思考u无需去除细胞壁u全能性受限制，不能培育成新的动物个体动物细胞融合技术与单克隆抗体动物细胞融合技术与单克隆抗体1概念：动物细胞融合也称_，是指_动物细胞结合形成_的过程。2原理：_。3诱导细胞融合的三种方法(1)物理法：如_、_等。(2)化学法：如_ (3)生物法：如_。4过程：5结果：融合后的杂交细胞具有原来_或_的遗传物质。细胞杂交细胞杂交两个或多个两个或多个 一个细胞一个细胞细胞膜的流动性离心离心电融合法电融合法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG)PEG)灭活病毒诱导法一、动物细胞融合两个两
3、个多个细胞多个细胞动物细胞融合特有的诱导方法细胞膜融合细胞膜融合细胞核融合细胞质融合细胞质融合融合完成的标志一、动物细胞融合技术仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（能诱导细胞融合）保留融合活性（能诱导细胞融合）1、什么是病毒的灭活？灭灭活是指用物理或化学手段活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力使病毒失去感染能力，但是并不破坏，但是并不破坏病毒的抗原结构。病毒的抗原结构。（二）问题：一、动物细胞融合技术病毒表面的病毒表面的糖蛋白糖蛋白和一些和一些酶酶与与细胞膜上的糖蛋白细胞膜上的糖蛋白发生作用发生作用，使，使细胞互相凝聚，细胞膜上的细胞互相凝聚
4、，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合细胞膜打开，细胞发生融合。2、灭活病毒诱导细胞融合的原理6.优点突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。一、动物细胞融合技术7.应用研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等能诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片一
5、、动物细胞融合技术（三）灭活病毒诱导细胞融合过程：一、动物细胞融合技术（八）传统抗体制备方法及缺陷不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原刺激浆细胞多种抗体筛选单一B细胞增殖分化一、动物细胞融合技术抗原不纯缺点：制备的抗体一般为多克隆抗体，产量低、纯度低，特异性差）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体1、科学家发现：单克隆抗体如何获得大量、单一的抗体？如何获得大量、单一的抗体？体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖2、需解决问题：3、遗憾：如何解决这一难题？如何解决这一难题？一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞 细胞群细胞群抗体抗体克隆二、单克隆抗体技术及其应用：
6、我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的思考讨论思考讨论思考讨论思考讨论：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备癌细胞动物细胞融合二、单克隆抗体及其应用一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体1975年，米尔斯坦和柯勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖二、单克隆抗体及其应用杂交瘤细胞 既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体用抗原注射小鼠从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养已免疫B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合多种杂交细胞二、单克隆抗体及其应用小鼠的脾脏中获取2、单克隆抗体的制备过程置于选择性培养基上培养
7、 2杂交瘤细胞 13第一次筛选多种杂交瘤细胞融合的细胞骨髓瘤细胞自身融合B细胞自身融合杂交细胞 132未融合的B淋巴细胞未融合的骨髓瘤细胞二、单克隆抗体及其应用克隆化培养抗体检测第二次筛选(抗原-抗体杂交技术)多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞阳性细胞二、单克隆抗体及其应用若杂交瘤细胞混合培养，得到的是能与特定抗原结合的多种抗体。此处将杂交瘤细胞进行有限稀释，虽然接种到细胞培养板上，每个培养孔只有一个杂交瘤细胞，这样每个孔培养得到的抗体就是单抗。注射到小鼠体内体外培养分离、提纯单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞细胞培养工程师在工作二、单克隆抗体及其应用【培养杂交瘤细胞的方
8、法比较【培养杂交瘤细胞的方法比较】项目项目腹腔培养体外培养优点优点缺点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高二、单克隆抗体技术及其应用单克隆抗体的制备过程动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选第二次筛选二、单克隆抗体及其应用诱导融合选择培养基克隆化培养，专一抗体检验体外培养或小鼠腹腔内增殖特异性强灵敏度高可大量制备既能大量繁殖又能产生专一抗体知识拓展：第一次筛选获得杂交瘤细胞细胞细胞合成合成DNAD
9、NA有有DD和和S S两条途径，其中两条途径，其中DD途径途径能能被被氨基蝶呤阻断阻断。人人B B淋巴细胞中有这淋巴细胞中有这两种两种DNADNA的合成的合成途径途径，但，但不能分裂增殖不能分裂增殖。鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤细胞中细胞中只有只有DD途径，没有途径，没有S S途径，但途径，但能不断分裂增殖能不断分裂增殖。如果如果DD途径被阻断，它会因不能合成途径被阻断，它会因不能合成DNADNA而死而死。筛选出杂交瘤细胞方法？B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长二、单克隆抗体及其应用培养基中加入氨基蝶呤阳性孔阳性孔抗体检测抗体检测
10、的方法的方法抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔多孔细胞培养板抗体检测板分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因筛选目的 筛选出？筛选出 的杂交瘤细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下
11、进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞能分泌所需抗体死亡抗体检测生长诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞思考讨论资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。二、单克隆抗体技术及其应用 在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕妇女体内胎盘
12、产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。抗抗（人绒毛膜促性腺激素）（人绒毛膜促性腺激素）单克隆单克隆抗体抗体思考讨论资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。二、单克隆抗体技术及其应用抗体药物接头细胞凋亡ADC被细
13、胞吞噬讨论1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。讨论2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？可用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。二、单克隆抗体技术及其应用讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床上各具有什么优势？单克隆抗体诊断试剂盒中的抗体只与特定的抗原反应，故特异性和灵敏度提高，生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻
14、保存和复苏利用，利于控制质量和标准化生产。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。二、单克隆抗体技术及其应用1、诊断试剂最广泛应用抗原-抗体杂交法抗抗人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素单克隆抗体单克隆抗体比原来诊断方法提前了比原来诊断方法提前了10d10d左右，左右，准确率在准确率在9090以上。以上。单克隆抗体的单克隆抗体的单克隆抗体的单克隆抗体的应用应用应用应用?具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：二、单克隆抗体及其应用思考讨论思考讨论思考讨论思考讨论:乙肝测定试剂艾滋病检测试剂二、单克隆抗体及其应用主要用于
15、癌症治疗。如：单克隆抗体+药物=“生物导弹”2、用于治疗疾病和运载药物优点：位置准确、疗效高、副作用小(“(“生物导弹生物导弹”单抗单抗导向导向，药物为药物为弹头弹头)二、单克隆抗体及其应用“生物导弹”追踪癌细胞动物细胞融合技术单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用1.动物细胞融合的概念、结果、原理、意义是什么2.动 物 细 胞 融 合 常 用 的 方 法，3.动 物 细 胞 融 合 和 植 物 体 细 胞 杂 交 的 比 较1.单克隆抗体制备的研究背景1.诊断试剂2.运载药物3.治疗疾病2.单克隆抗体制备动物细胞融合技术与单克隆抗体课堂小结本节小结一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂
16、交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株练习与应用C2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体练习与应用A练习与应用二、拓展应用假如你掌
17、握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株练习与应用C2.
18、科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A练习与应用下面为制备单克隆抗体和多克隆抗体的示意图，据图回答下列问题：（1）图中向小鼠注射抗原后，所获得的免疫抗血清实际上是含有_ _ _（填写抗体的名称）的混合物，这种方法制备的抗体不仅产量低，而且纯度低。与其相比，单克隆抗体突出的优点在于它的_ _，并
19、能大量制备。（2）图中选用B细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，说明细胞膜具有_；如果仅考虑细胞的两两融合，其融合细胞有_种类型。（3）图中两次筛选的目的不同，其中筛选的目的是筛选出_ _，筛选的目的是筛选出_ _。（4）科学工作者正在研究的用于治疗癌症的“生物导弹”就是_ _，请指出一种用“生物导弹”治疗癌症的方法较普通化疗的优点_ _。Ab1.Ab2.Ab3.Ab4特异性强、灵敏度高流动性3杂交瘤细胞能产生所需抗体的杂交瘤细胞单抗隆抗体上连接抗癌药物不损伤正常细胞，且用药剂量少，毒副作用小【情境】“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼,由单克隆抗体与药物结合而成,单克隆抗体的制备过程如图2-2
20、-5所示。分析(1)图中B过程表示,与原生质体融合相比,该过程特有的诱导方为。(2)若只考虑细胞两两融合,B过程会获得种类型的细胞。经特定选择培养基筛选后,和融合的的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长。灭活病毒诱导法3具有同种核未融合的亲本细胞动物细胞融合(3)注射到小鼠体内进行培养的细胞具有的特点是。(4)图示过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体,理由是。(5)“生物导弹”中单克隆抗体的作用是。(6)除“生物导弹”外,请说出单克隆抗体在临床上的其他应用(答出两点)。小鼠形成的抗体对人体来说是抗原,存在着排异反应将药物定向运到靶细胞作为诊断试剂;单克隆抗体自身也能用于治疗疾病。既能无限增殖又能产生特定抗体二、拓展应用假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。练习与应用