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1、精选优质文档-倾情为你奉上在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，
2、添加时多加G或C，反之亦反。EnzymeOligo Sequence Chain Length % Cleavage 2 hr 20 hr GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 90 90 90 90 90 CG
3、GATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 90 90 25 90 90 CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 90 90 GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 90 GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 90 CATCGATG G
4、ATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 90 50 0 0 90 50 GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 90 90 90 90 90 90 GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 GACGCGTC
5、 CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 90 90 GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATAT
6、GCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10 10 25 25 0 10 10 90 90 TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 90 90 90 TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10 12 0 0 0 0 25 90 GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0
7、 25 50 90 GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0 10 90 90 0 0 10 90 90 0 CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0 10 0 0 25 10 CGAGCTCG 8 10 10 GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 90 GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCT
8、TGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75 GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75 CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 10 90 10 10 50 90 GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 8 10 12 14 10 10 0 0 90 90 50 50 GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATG
9、CATGT 8 12 14 0 0 10 0 25 50 AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 90 90 90 90 90 90 CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 12 14 0 90 75 75 0 90 90 90 CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 8 10 12 0 10 10 0 25 75 CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 8 10 12 14 0 25 50 90 0 75 90 90专心-专注-专业