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1、第一节 PCR技术的基本原理第二节 PCR反应体系中的各 种组分分析第三节 PCR技术的分类第四节 PCR技术的应用第五节 DNA分子标记内容第1页/共197页第一页，编辑于星期六：十二点 十五分。基因克隆目的基因的分离和制备目的基因的体外重组重组子导入宿主细胞第2页/共197页第二页，编辑于星期六：十二点 十五分。第3页/共197页第三页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCRPolymerase chain reaction，聚合酶链式反应PCR的最早设想：1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆
2、tRNA基因”。PCR的实现：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。1985年公开报道第4页/共197页第四页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR1987年PCR得到美国的专利权1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖第5页/共197页第五页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR技术操作简便，可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增109倍，且无需烦琐的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。第6页/
3、共197页第六页，编辑于星期六：十二点 十五分。第一节 PCR技术的基本原理一、PCR技术的基本原理二、PCR扩增过程三、PCR技术的特点第7页/共197页第七页，编辑于星期六：十二点 十五分。一、PCR技术的基本原理依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNA pol的作用下合成新生的DNA互补链。第8页/共197页第八页，编辑于星期六：十二点 十五分。二、PCR扩增过程变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension
4、）第9页/共197页第九页，编辑于星期六：十二点 十五分。1、高温变性在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA变性温度：9497，常95 3050s，常30s变性引物第10页/共197页第十页，编辑于星期六：十二点 十五分。2、低温退火当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物于其互补的模板在局部形成杂交链。退火温度：2560，常55 6090s，常60s第11页/共197页第十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。3、适温延伸在DNA pol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸
5、反应延伸温度：7074，常72 60120s第12页/共197页第十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR原理第13页/共197页第十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR扩增过程PCR扩增过程第14页/共197页第十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR原理第15页/共197页第十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR的反应动力学 理论上为2n。30次循环，DNA产量达109拷贝实际上为(1+R)n。R为扩增效率，平均为75%30次循环，DNA产量实际为106-107拷贝第16页/共197页第十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。三、PCR技术的特点高度的敏感性高度的特异性操
6、作简便、快速适用样品的广泛性第17页/共197页第十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。高度的敏感性可将极微量（pg级）DNA扩增到紫外光下可见的水平（g级）从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌对单拷贝基因、单根头发、一滴血等微量标本进行分析第18页/共197页第十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。高度的特异性PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。第19页/共197页第十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。高度的特异性PCR扩增的特异性依赖于两个引物的好坏，依赖于引
7、物与模板结合的正确性只要引物设计合理、反应温度适宜，PCR的特异性是相当高的第20页/共197页第二十页，编辑于星期六：十二点 十五分。操作简便快速PCR仪1-2小时或数小时扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广第21页/共197页第二十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR仪生产厂家中国科学院遗传研究所复旦大学北京市应用新技术研究所美国Perkin Elmer公司的TC1、480、9600瑞典Pharmacia公司的Gene ATAGTM PCR第22页/共197页第二十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR仪种类机械手臂式（转移式）PCR变温式（固定式）PC
8、R第23页/共197页第二十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR仪第24页/共197页第二十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。techgene 英PCR仪SRX-481高效水冷全自动基因扩增仪第25页/共197页第二十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。半导体式全自动PCR仪第26页/共197页第二十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。适用样品的广泛性对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。可以DNA或RNA，纯化的或粗制的；新鲜组织或陈旧样品；细胞或
9、体液；完整大分子或部分降解的DNA第27页/共197页第二十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。第二节 PCR反应体系中的各组分分析一、引物二、DNA pol三、DNA模板四、dNTPs五、PCR反应的缓冲液六、Mg2+七、PCR反应条件的选择八、标准的PCR反应体系第28页/共197页第二十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。一、引物引物的设计决定PCR反应的成败PCR的效率和特异性取决于：1、引物与模板的特异结合2、聚合酶对引物的有效延伸第29页/共197页第二十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。引物设计原则1、引物长度以16-30为宜引物过短，特异性降低引物过长，成本增加，PCR的最适
10、延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点若引物长16bp，则平均每隔416=4.29109bp有一个结合位点。第30页/共197页第三十页，编辑于星期六：十二点 十五分。引物设计原则2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3端，不应有连续3个G或C5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二
11、聚体，产生非特异的扩增条带。第31页/共197页第三十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。引物设计原则6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体7、引物3端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3端T影响最大，因此，3端的末位碱基最好选ACG，而不选T。8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源第32页/共197页第三十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。引物设计原则9、引物5端可以修饰加酶切位点；用生物素、荧光物质、地高辛等标记；引入突变位点；引入启动子序列；引
12、入蛋白质结合序列5端修饰后不影响正常的PCR反应第33页/共197页第三十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。常用引物修饰法引物修饰法引物修饰法用途用途酶切位点酶切位点便于克隆便于克隆噬菌体启动子噬菌体启动子合成合成RNA探针、测序探针、测序蛋白质结合序列蛋白质结合序列产物纯化、检测产物纯化、检测核糖体结合位点核糖体结合位点高效表达高效表达同位素同位素检测、定量检测、定量生物素生物素检测、纯化、定量检测、纯化、定量荧光素荧光素检测、纯化、定量检测、纯化、定量酶酶检测检测返回第34页/共197页第三十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。引物的保存和使用浓度冻干，-20，可保存1年，常保存6月使用
13、最终浓度：0.2-1.0mol/L，适宜小于0.2mol/L，影响产量大于1.0mol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体第35页/共197页第三十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。二、DNA PolMullis最初使用的DNA聚合酶是E.coli DNA pol I 的Klenow片段缺点：1、Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。2、引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。第36页/共197页第三十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。T4 DNA pol和T7 DNA pol1988年初
14、，Keohanog改用T4 DNA pol进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。T7 DNA pol第37页/共197页第三十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol的发现1976年，Chein分离出一种热稳定的聚合酶1986年，Erlich从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离并纯化了Taq DNA pol，生长在70-75极富含矿物质的环境中1988年，等成功将Taq DNA pol应用于PCR。第38页/共197页第三十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。用于PCR的pol种类水生栖热菌(Thermus
15、 aquaticus)yT1株分离提取的Taq DNA pol。嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）提取的Tth DNA pol，活性是Taq DNA pol的100倍栖热球菌（Thermococcus litoralis）中分离的VENT酶，100时半衰期达95min酸热浴硫化裂片菌中分离的Sac酶，耐受100第39页/共197页第三十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。各种耐热DNA pol的特性TaqTthVENTSac必需金属离子必需金属离子Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+3-5外切活性外切活性+5-3外切活性外切活性+耐受耐受100+第40页/共197页第四十页，编
16、辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol的特点耐高温。在70下反应2h后其残留活性是原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)第41页/共197页第四十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol酶活性75-80，150bp/s72，100bp/s70，60bp/s55，22bp/s37，1.5bp/S22，0.25bp/s第42页/共197页第四十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。离子依赖性 T
17、aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感 Mg2+浓度过低，Taq酶活力下降；Mg2+浓度过高，使酶催化非特异性扩增第43页/共197页第四十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol的忠实性Taq DNA pol具 有 53聚 合 酶 活 性 和 53外 切 酶 活 性，而 无35外切活性，因而无效正阅读功能，在扩增中可引起错配。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4.降低Mg2+浓度（1.5mmol/L），降低dNTPs浓度（20mol/L），提高退火温度（大于55），缩短延伸时间（60s）可提高Taq DNA pol的忠实性，此
18、时的平均错配率为5 10-6.第44页/共197页第四十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol的抑制剂 低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA pol的催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷基肌氨酸钠(小于0.02%)，SDS(小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性.非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40和Tritox-100)如5%时方能 抑制该酶的活性.第45页/共197页第四十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol的灭活100加热10min以
19、上加入10 mmol/L EDTA，使其结合Mg2+第46页/共197页第四十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。Taq DNA pol的使用浓度和生产厂家每100l反应液中含2.5l Taq DNA pol为宜Taq DNA pol应于-20保存复旦大学、中科院遗传所、军事医学科学院、上海华美公司不同厂家酶的定位及生产条件不同，可根据具体情况区别使用第47页/共197页第四十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。三、DNA 模板模板的来源培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本、血液、毛发、尿液、犯罪现场DNA 或RNA，RNA作模板时要反转录成cDNA第48页/共197页第四十八页，编
20、辑于星期六：十二点 十五分。DNA 模板的用量理论上102-104拷贝的模板可满足各种要求的PCR反应E.coli DNA0.1ng3104拷贝人染色体DNA0.1g3104拷贝酵母DNA1ng 3104拷贝第49页/共197页第四十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。DNA 模板的纯度DNA样品尽量要纯，尤其不能有核酸酶及蛋白酶等大多PCR，对DNA模板的要求不严格，存在一定量的蛋白质、SDS等对实验影响不大没有交叉污染第50页/共197页第五十页，编辑于星期六：十二点 十五分。DNA模板的制备传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K
21、来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用 第51页/共197页第五十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。DNA模板的制备SDS溶解细胞膜上的脂类与Pr，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS与Pr结合而沉淀；蛋白酶K水解消化Pr，特别是与DNA结合的组蛋白，再用酚与氯仿抽提Pr和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的Pr使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防
22、止RNase降解RNA。第52页/共197页第五十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。四、dNTPSdATP、dTTP、dGTP、dCTP.dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性dNTP溶液呈酸性，使用时应用1M NaOH将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解第53页/共197页第五十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。dNTP的浓度PCR常用的dNTP浓度为50200umol/L4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。dNTP浓度过低会使反应速度下降，降低PCR产物的产量，但可提
23、高实验的精确性。dNTP浓度过高，可加快反应速度，但也增加碱基的错配率和实验成本dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。第54页/共197页第五十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。五、PCR反应的缓冲液PCR中常使用10-50mmol/L Tris-HCl（pH8.3-8.8）缓冲液作用：调节pH值，使Taq DNA pol作用环境维持偏碱性第55页/共197页第五十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。缓冲液配方10-50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，有利于引物退火，大于此浓度会抑制Taq DNA pol的活性100g/L BSA（小牛血清），保护酶0
24、.05-0.1%Tween-20，保护酶5mmol/L DTT（二硫苏糖醇），保护酶10%DMSO（二甲基亚砜），减少模板二级结构，提高反应特异性5%甲酰胺或5%氯化四甲基胺（TMAC），提高反应特异性，对酶活性无明显影响第56页/共197页第五十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。六、Mg2+浓度PCR反应体系中，dNTPs、引物、DNA 模板等中的磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+浓度Mg2+浓度要比dNTP的浓度高0.2-2.5mmol/L在 一 般 的 PCR反 应 中，各 种 dNTP浓 度 为 200umol/L时，Mg2+浓 度 为 1.52.0mmol/L为宜。第57页/
25、共197页第五十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。七、PCR反应条件的选择变性温度和时间退火温度和时间延伸温度和时间循环次数第58页/共197页第五十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。变性温度与时间DNA中GC含量越高，要求的变性温度越高通常为9530s，或9394lmin第一次反应时反应管达到所需温度需要一段时间，因此要适当延长时间。最好为95，4-6min，在以后的循环中，变性步骤设为9530s为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管中加入液体石蜡第59页/共197页第五十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。退火温度与时间退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序
26、列的长度。对于20个bp，G+C含量约50%的引物，55为最适退火温度较为理想。公式帮助选择合适的温度：Tm=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。第60页/共197页第六十页，编辑于星期六：十二点 十五分。延伸温度与时间PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb
27、的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些第61页/共197页第六十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。延伸终止最后一个反应循环结束后，应使PCR反应在72进一步延伸5min，以提高产物的扩增率，然后将反应混合液冷却至4，或加入EDTA到10mmol/L终止反应第62页/共197页第六十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。第63页/共197页第六十三页，编
28、辑于星期六：十二点 十五分。八、标准的PCR反应体系10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L2个引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul第64页/共197页第六十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。九、PCR扩增产物的分析凝胶电泳分析酶切分析分子杂交核酸序列分析第65页/共197页第六十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。凝胶电泳分析PCR产物电泳，EB染色紫外分析仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符
29、合预计的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳：通常用12%的琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析第66页/共197页第六十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。凝胶电泳分析第67页/共197页第六十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。PCR扩增P53基因第68页/共197页第六十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。酶切分析根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。第69页/共197页第六十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。
30、PCR产物的酶切第70页/共197页第七十页，编辑于星期六：十二点 十五分。分子杂交分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。Southern blotting：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：将PCR产物点在NC膜或尼膜膜上，再与内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。第71页/共197页第七十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。核酸序列分析是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
31、第72页/共197页第七十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。十、常见问题分析与对策假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异性扩增带出现片状拖带或涂抹带 PCR污染与对策 第73页/共197页第七十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节：模板核酸的制备引物的质量与特异性酶的质量PCR循环条件第74页/共197页第七十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性的原因模板模板中含有杂蛋白质模板中含有Taq酶抑制剂模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚模板核酸变性不彻底第75页/共197页第七十五页，编辑于星期六：
32、十二点 十五分。假阴性的原因酶失活酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭第76页/共197页第七十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性的原因引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。选定一个好的引物合成单位引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。第77页
33、/共197页第七十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性的原因Mg2+浓度Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。第78页/共197页第七十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性的原因反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。第79页/共197页第七十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性的原因物理原因变性温度低，变性
34、时间短，极有可能出现假阴性退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率用标准的温度计检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一第80页/共197页第八十页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阴性的原因靶序列变异靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的第81页/共197页第八十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阳性所有样品均为阳性引物设计不合适靶序列或扩增产物的交叉污染第82页/共197页第八十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阳性
35、的原因引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性需重新设计引物第83页/共197页第八十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。假阳性的原因靶序列或扩增产物的交叉污染1、整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻放，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。第84页/共197页第八十四页，编辑于星期六：十
36、二点 十五分。假阳性的原因靶序列或扩增产物的交叉污染2、空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生第85页/共197页第八十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带第86页/共197页第八十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。出现非特异性扩增带的原因引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现
37、，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。第87页/共197页第八十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。出现非特异性扩增带采取的对策必要时重新设计引物减低酶量或调换另一来源的酶降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。第88页/共197页第八十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带第89页/共197页第八十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。出现片状拖带的原因酶量过多或酶的质量差dNTP浓度过高Mg2+浓度过高退火温度过低循环次数过多第90页/共197页第九十页，编辑于星期六：
38、十二点 十五分。出现片状拖带的对策减少酶量，或调换另一来源的酶减少dNTP的浓度适当降低Mg2+浓度增加模板量减少循环次数。第91页/共197页第九十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。污染原因1、标本间交叉污染标本污染主要有收集标本的容器被污染标本放置时，由于密封不严溢于容器外容器外粘有标本而造成相互间交叉污染标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染有些微生物标本尤其是病毒可随气体扩散，导致彼此间的污染.第92页/共197页第九十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。污染原因2、PCR试剂的污染主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污
39、染.第93页/共197页第九十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。污染原因3、PCR扩增产物污染，这是PCR反应中最主要最常见的污染问题因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题第94页/共197页第九十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。污染原
40、因4、实验室中克隆质粒的污染在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大第95页/共197页第九十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.阳性对照阴性对照重复性试验选择不同区域的引物进行PCR扩增第96页/共197页第九十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。阳性对照在建立PCR反应实验室及一般的检验
41、单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等，重复性好，经各种鉴定是该产物的标本如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.第97页/共197页第九十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。阴性对照每次PCR实验务必做阴性对照标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.试剂对照
42、:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.第98页/共197页第九十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。防止污染的方法合理分隔实验室:将样品的处理、配制、PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分标本处理区；PCR反应液制备区；PCR循环扩增区；PCR产物鉴定区。实验用品及吸样枪应专用实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA第99页/共197页第九十九页，编辑于星期六：十二点 十五分。防止污染的方法吸样枪：吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样
43、品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染第100页/共197页第一百页，编辑于星期六：十二点 十五分。防止污染的方法预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱第101页/共197页第一百零一页，编辑于星期六：十二点 十五分。防止污染的方法防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使
44、用.设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照第102页/共197页第一百零二页，编辑于星期六：十二点 十五分。防止污染的方法减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出.第103页/共197页第一百零三页，编辑于星期六：十二点 十五分。第三节 PCR技术的分类正常PCR巢式PCR复合PCR不对
45、称PCR反转录PCR反向PCR锚定PCR原位PCR免疫PCR彩色PCR修饰引物PCR固着PCR膜结合PCR重组PCR第104页/共197页第一百零四页，编辑于星期六：十二点 十五分。正常PCR（Normal PCR）一般的DNA模板采用一对引物，经30轮左右循环扩增，即可达到预期的目的常用于多拷贝DNA分子的扩增PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳返回第105页/共197页第一百零五页，编辑于星期六：十二点 十五分。巢式PCR（Nested PCR）先用一对引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后再用另一对引物扩增第一次PCR产物第106页/共197页第一百零六页，编辑于
46、星期六：十二点 十五分。第一次PCR第二次PCR外引物（outer-primer）内引物（inter-primer）第107页/共197页第一百零七页，编辑于星期六：十二点 十五分。分类半巢式PCR中途进退式PCR第108页/共197页第一百零八页，编辑于星期六：十二点 十五分。半巢式PCRSemi-nested PCR只有一个外引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后用另一对内引物扩增PCR产物第109页/共197页第一百零九页，编辑于星期六：十二点 十五分。中途进退式PCRDrop-in Drop-out PCR外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退
47、火温度，而第二次PCR采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高的退火温度内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干循环,待外引物基本消耗完毕后,无须取出第一次PCR产物,只需降低退火温度,即可直接进行第二次PCR扩增.第110页/共197页第一百一十页，编辑于星期六：十二点 十五分。巢式PCR的应用用于极少量模板的扩增第111页/共197页第一百一十一页，编辑于星期六：十二点 十五分。复合PCRMultiplex PCR，多重引物PCR，多重PCR在同一PCR反应中，用多组引物同时扩增几个基因片段的技术第112页/共197页第一百一十二页，编辑于星期六：十二点 十五分。第1
48、13页/共197页第一百一十三页，编辑于星期六：十二点 十五分。复合PCR产物的电泳图谱1234marker第114页/共197页第一百一十四页，编辑于星期六：十二点 十五分。复合PCR的应用1、多种病原微生物的同时检测或鉴定肝炎病毒的感染：甲乙丙型肝炎病毒肠道致病性细菌的检测：伤寒，痢疾和霍乱性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.第115页/共197页第一百一十五页，编辑于星期六：十二点 十五分。复合PCR的应用2、病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型
49、鉴定乙型肝炎病毒的分型乳头瘤病毒的分型单纯疱疹病毒的分型杜氏肌营养不良症的分型癌基因的检测等第116页/共197页第一百一十六页，编辑于星期六：十二点 十五分。复合PCR的应用3、多点突变性分子病的诊断与疾病相关的基因十分庞大，如Rb（视网膜母细胞瘤）基因有数百个kb，而DMD（进行性肌营养不良症）有2000kb。基因上有多处位点发生缺失或突变。采用复合PCR可在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就会消失第117页/共197页第一百一十七页，编辑于星期六：十二点 十五分。多重PCR的特点高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原
50、微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.第118页/共197页第一百一十八页，编辑于星期六：十二点 十五分。不对称PCRasymmetric PCR用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001.第119页/共197页第一百一十九页，