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1、细胞室1.准备室：用于进行培养器皿的清晰、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等.2.缓冲间：为了减少将外界污染源头带入培养室3.培养室：是专门用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。第1页/共43页体外培养的设备和器具1.超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、液氮保存罐、离心机、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、酶标仪2.过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器第2页/共43页超净工作台利用鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，徐徐通过工作台面，在操作区形成无菌环境。按气流方向的不同分为：1.外流式，2.侧流式第3页/共43页
2、CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：使用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒。箱内灭菌蒸馏水3升，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。第4页/共43页自动双重纯水蒸馏器第5页/共43页培养器皿1.一次性培养瓶和培养板：一般朔料培养器皿的细胞生长面带负电荷，有利于大多数表面带正电荷的细胞贴壁生长2.玻璃培养瓶、溶液瓶、移液管第6页/共43页常用玻璃器皿清洗1.浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，以达到软化器皿表面所附着物质，并中和器皿表面的碱性物质。2.刷洗：用软毛毛刷将浸泡后的其面在洗涤剂水中反复刷
3、洗，以除去表面杂质。3.浸酸：利用强氧化作用清除器皿表面可能残留的有机物,时间在6小时以上最好过夜。4.冲洗：反复注满水、倒空达20次以上。最后用二次水浸洗23次，烘干后包装。第7页/共43页清洁液的配制第8页/共43页胶塞和塑料用品的清洗先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分钟，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后分别用自来水和三次水各冲洗3次，烘干备用。第9页/共43页过滤除菌装置1.不锈钢板式滤器：2.微孔滤膜滤器：有可换膜式滤器和一次性滤器两大类。第10页/共43页细胞培养的概念原代培养：就是初次培养，即培养物一经接种到培养皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换生长
4、器皿。它包括：细胞培养、组织培养、器官培养。传代培养：随着培养时间的延长、细胞分裂繁殖，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止，在这种情况下，都需要将培养物分割成小的培养。第11页/共43页原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代培养期衰退期第12页/共43页体外细胞培养物的生长类型贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。第13页/共43页每代贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结
5、束潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。其机制：接触抑制、密度依赖性。第14页/共43页第15页/共43页第16页/共43页传代的方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细
6、胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶第17页/共43页贴壁生长细胞传代方法1.吸光培养瓶中的培养液,用PBS溶液清洗2-3次。2.加入1-2ml0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7.将后者放入培养箱中培养。第18页/共43页培养细胞生长的条件1.细胞的营养需要2.细胞的生存环境温度:37
7、O2CO2:5%CO2+H2OH2CO3H+HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒第19页/共43页细胞培养用液水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4H2O1.56gKH2PO40.20g加水至1000mlPH值调至7.2-7.4第20页/共43页消化液1.胰蛋白酶：主要用的是0.25胰蛋白酶液，胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，过滤除菌。它作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。浓度越高，作用越强，但超过一定
8、限度会损伤细胞。用含血清培养液终止其消化作用。2.EDTA：是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解离作用。毒性小、价格便宜、使用方便。3.胶原酶溶液：又称羧肽酶，有胶原酶、型及肝细胞专用胶原酶5种，可根据制备不同组织细胞悬液选择不同类型的胶原酶第21页/共43页培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。第22页/共43页1.天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染。2.合成培养基：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模
9、拟合成的。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要，还需补充一定量的天然培养基（如血清）第23页/共43页常用血清有：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。第24页/共43页血清中含有：1.多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）2.多种金属离子；3.激素；4.促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。5.各种生长因子6.转移蛋白7.不明成分第25页/共43页一般说来含5小牛血
10、清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加10血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞第26页/共43页血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）
11、：56，30分钟血清的消毒：过滤除菌第27页/共43页抗菌素的使用在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定第28页/共43页完全培养基的组成基础培养基8095血清520HEPES、碳酸氢钠按培养基的类型添加青、链霉素各100单位毫升第29页/共43页RPMI-1640培养基的配制：RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.2gHEPES2.385g青、链霉素各100单位毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2-7.4加血清（终浓
12、度10）第30页/共43页细胞冻存和复苏冷冻保存就是将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至超低温条件，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏是一定的复温速率将冻存的培养物回复到常温的过程。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第31页/共43页慢冻程序标准程序：当温度在-25以上时，12/min当温度达-25以下时，510/min当温度达-100时，可迅
13、速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。第32页/共43页低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第33页/共43页细胞冻存方法1.冻存液配制：含20%血清培养基,10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻
14、存液,用吸管吹打制成细胞悬液（11065106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4.年后，存活率可达80以上。DMSO液用培养液配好，5.避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究证第34页/共43页细胞复苏方法1.从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）。2.5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。3.低速离心10分钟。4.去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第35页/共43页培养细胞活力测定任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手
15、段之一。1.细胞克隆形成率实验2.台盼蓝法3.四唑盐（MTT）比色法第36页/共43页1.细胞克隆形成率实验：单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠第37页/共43页2.台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。血细胞计数器：手工计数细胞第38页/共43页3.四唑盐（MTT）比色法 MTT名为噻唑蓝，其原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结
16、晶物，溶液颜色深浅与所含的蓝紫色产物量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。第39页/共43页操作步骤:1.单细胞悬液接种于96孔培养板，每孔培养基总量200微升、37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）。2.加入5毫克毫升的MTT液（20微升孔），继续培养4小时。3.吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。4.酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果，绘制曲线。第40页/共43页第41页/共43页第42页/共43页感谢您的观看！第43页/共43页