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1、铜绿假单胞菌第1页/共24页实验目的n了解铜绿假单胞菌的微生物学特性n掌握微生物实验技术基本原理及操作n熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及 方法第2页/共24页概述 铜绿假单胞菌惯称绿脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他菌强，抗干燥的能力也强。第3页/共24页生物学特性n 形态：革兰氏阴性杆菌，菌体长短不一；单端单鞭毛；动力阳性；无芽胞。n特性：专性需氧；生长温度范围是2542，最适生长温度35，4不生长。第4页/共24页生物学特性n抗原性:O O抗原 H H抗原粘液抗原R R抗原菌毛抗原n产生荧光素和水
2、溶性的绿脓素，培养物呈蓝绿色。第5页/共24页生物学特性n在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；n在普通平板、血平板、麦康凯平板上可形成5 5种不同形态的菌落典型型粘液型侏儒型粗糙型大肠菌样型第6页/共24页生物学特性n菌落呈灰绿色，大小 不一,扁平湿润，边缘不规则呈伞状伸展，表面常可见金属光泽。典型型（麦康凯平板）第7页/共24页生物学特性n产绿脓素琼脂染成黄绿色典型型（普通平板）第8页/共24页生物学特性n菌落光滑凸起 成粘液状粘液型（血平板）粘液型（麦康凯平板）第9页/共24页生物学特性n菌落中央凸起 边缘扁平 表面粗糙粗糙型（麦康凯平板）第10页/
3、共24页生物学特性n菌落圆形凸起 似大肠埃希菌菌落大肠型（麦康凯平板）n细小，无光泽 半透明菌落侏儒型（麦康凯平板）第11页/共24页生化特性n 氧化酶：+n 葡萄糖的氧化（O/FO/F）：O On 枸橼酸盐利用：+n 精氨酸双水解：+n 明胶液化：+n 硝酸盐还原：+n 乙酰胺酶：+n 吲哚试验：-第12页/共24页微生物学检验第13页/共24页脓液 痰 尿液等直接涂片、革兰染色、镜检分离培养（血平板、麦康凯）18-24h35可疑菌落（金属光泽、-溶血、产绿色素、特殊气味）初步鉴定最终鉴定色素鉴定生化反应42生长分型（血清学 噬菌体）革兰阴性杆菌，氧化酶阳性菌落特征气味绿脓素报告检验程序药敏
4、试验第14页/共24页试验材料n病料：痰液标本n试剂：氧化酶纸片，明胶、革兰染色液、药敏纸片、无菌生理盐水及生化管配套试剂等 n培养基：普通平板、血平板、麦康凯平板、半 固体培养基、非发酵菌微量生化管等n其它 ：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、平皿等第15页/共24页分离培养n标本采集：脓液、浓痰（无菌拭子）n痰液标本的前处理加入等量的PH 7.6 的1%胰酶溶液，放置35、90 min使痰液均质化。n直接涂片，革兰氏染色，镜检n分别接种普通平板、血平板和麦康凯平板，培养1824h，进一步进行鉴定。第16页/共24页初步鉴定n选出可疑菌落 金属光泽、-溶血、产绿色
5、素、特殊气味等n初步鉴定染色镜检：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。氧化酶试验：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一滴新配制的5%二甲基对苯二胺试剂，15-30min内，出现红色至紫红色，为阳性；若不变色，为阴性。第17页/共24页绿脓菌素试验：选取可疑菌落2-32-3个，置于绿脓菌素测定用培养基，于3737培养24h24h，加入氯仿、色素后，再加入盐酸 ，上层稀盐酸液内出现红色为阳性，表示菌落中含有绿脓菌素。初步鉴定第18页/共24页最终鉴定n明胶液化试验：选取可疑菌落的纯培养物，穿刺接种于明胶培养基内，3737培养24h24h，取出后放入冰箱10-30min10-30min，如若溶解，即试验呈阳
6、性；如凝固不溶，试验呈阴性。n硝酸盐还原试验：选取可疑菌落的纯培养物，接种于硝酸盐培养基，置于3737培养24h24h，如若培养基中的小倒管内有气体，试验呈阳性。第19页/共24页最终鉴定n吲哚试验：选取可疑菌落的纯培养物接种于蛋白胨水，培养8h-24h8h-24h后，加KovacsKovacs（靛基质）试剂约3mm3mm高，如若在液层界面发生红色，即为阳性反应。n4242生长试验：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜面培养基上，于4242培养4h4h，铜绿假单胞菌能生长为阳性反应。第20页/共24页血清学鉴定n血清群鉴定：取洁净玻片，滴加多价O血清于玻片，再接种此菌的纯培养物少许混匀，2min观察凝集现象，鉴定。n血清学分型：按血清分型试剂盒操作说明进行操作：将待检测菌在LB琼脂培养基中过夜培养，取少许与30L阳性血清混合，一分钟观察结果。n判定标准：有凝集块出现，且生理盐水空白对照组不凝集者为阳性。第21页/共24页药敏试验n扩散法（K-BK-B法）选用抗菌药物，对分离的细菌进行敏感性试验：药敏片：庆大霉素、环丙沙星、头孢噻肟、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、头孢哌酮、青霉素；根据抑菌圈的大小判断病原菌对药物的敏感程度。第22页/共24页第23页/共24页感谢您的观看！第24页/共24页