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1、专题一专题一 基因工程基因工程第1讲 DNA重组技术的基本工具第1页/共35页温故知新：核酸的类型温故知新：核酸的类型概念：细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的概念：细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传遗传、变异变异和和蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成中具有极其重要的作中具有极其重要的作用。用。脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)核糖核酸核糖核酸(RNA)基本单位：基本单位：脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸碱基种类：碱基种类：A、G、C、T基本单位：基本单位：碱基种类：碱基种类：A、G、C、U类类型型第2页/共35页温故知新：核酸的空间结构温故知新：核酸的空间结构1.DNA分
2、子是由分子是由两条反向平两条反向平行行的脱氧核苷酸长链盘旋成的脱氧核苷酸长链盘旋成的的双螺旋结构双螺旋结构2.DNA分子中的脱氧核糖和分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接磷酸交替连接,排列在外侧排列在外侧,构构成成基本骨架基本骨架;碱基排列在内侧碱基排列在内侧3.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过氢键氢键连接起来连接起来,形成碱基对形成碱基对,且遵且遵循循碱基互补配对原则碱基互补配对原则。第3页/共35页温故知新：基因温故知新：基因概念：基因是有遗传效应的DNA片段，是生物体遗传的 结构单位和功能单位。作用：控制生物性状，指导蛋白质的生物合成。第4页/共35页温故知新：基因工程温故知新：基因工程
3、概念：基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后转入到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。也称为转基因技术。原理：原理：基因重组基因重组优点：优点：克服了远缘杂交不亲和的障碍克服了远缘杂交不亲和的障碍；周期短；周期短；目的性强目的性强第5页/共35页 为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上并成功表达？1、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则。所以不同的生物DNA可以嫁接。2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一
4、种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达。思考与讨论思考与讨论第6页/共35页基因工程的应用之一：生产胰岛素（复习糖尿病相关知识）第7页/共35页人的细胞人的细胞提取提取胰岛素基因胰岛素基因与运载体与运载体DNA拼接拼接导入导入上述生产胰岛素的关键步骤是什么？细菌细菌(含胰岛素基因含胰岛素基因)生产胰岛素生产胰岛素基因工程生产胰岛素简要过程基因工程生产胰岛素简要过程：第8页/共35页胰岛素基因的获取胰岛素基因导入受体细胞胰岛素基因与运载体连接基因工程生产胰岛素的关键步骤：基因工程生产胰岛素的关键步骤：第9页/共35页基因的基因的“剪刀剪刀”限制性内切酶限制性内切酶基因的基因的“针线针线”DN
5、A连接酶连接酶基因的运输工具基因的运输工具运载体运载体基因工程的操作工具基因工程的操作工具操操作作工工具具第10页/共35页大肠杆菌的一种ECORI限制酶识别GAATTC序列，并在G和A之间切开）。基因的“剪刀”限制性核酸内切酶基因工程的操作工具基因工程的操作工具第11页/共35页基因工程的操作工具基因工程的操作工具基因的“剪刀”限制性核酸内切酶酶切位点：特定序列核苷酸的磷酸二酯键酶切位点：特定序列核苷酸的磷酸二酯键第12页/共35页酶切位点酶切位点 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。黏性末端：黏性末端基因工程的操作工具基因工
6、程的操作工具第13页/共35页不同的限制性内切酶得到的黏性末端不同第14页/共35页中轴线在G与C之间切割SmaI只能识别只能识别CCCGGG序列，并在序列，并在C和和G之间切开。之间切开。SmaI限制酶的作用限制酶的作用第15页/共35页平末端：平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口两条单链的切口是平整的，这样的切口叫叫平末端平末端。平末端平末端平末端平末端SmaI限制酶的作用限制酶的作用第16页/共35页G A A T T CC T T A A GEcoR中轴线中轴线 C C C G G GG
7、 G G C C CSma黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端黏性末端黏性末端 第17页/共35页仔细观察各限制酶识仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特别的特定序列有何特点？点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列第18页/共35页限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6 6个碱基还是4 4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列限制酶的识别序列限制酶的识别序列第19页/共35页同一种内切酶要切两个切口，产生四个黏性同一种内切酶要切两个切口，产生四个黏性末端。末端。会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性会产生相同的黏
8、性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。分子了。Q1：要想获得某个特定性状的基因必须要用：要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？Q2：如果把两种来源不同的：如果把两种来源不同的DNA用同一种用同一种限制酶来切割，会怎样呢？限制酶来切割，会怎样呢？思考与讨论思考与讨论第20页/共35页G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C
9、GG C T T A A A A T T C G第21页/共35页基因的针线DNA连接酶 DNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来来，即把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯形成磷酸二酯键键)，这样一个重组的，这样一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。(连接连接“梯子梯子”断口的断口的“扶手扶手”而非而非“梯子梯子”中间的中间的“踏板踏板”)”)基因工程的操作工具基因工程的操作工具第22页/共35页DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝
10、合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低基因工程的操作工具基因工程的操作工具第23页/共35页A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶基因工程的操作工具基因工程的操作工具第24页/共35页DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将只能将单个核苷酸单个核
11、苷酸连接到已有的连接到已有的DNA片段上，形成磷酸片段上，形成磷酸二酯键二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较第25页/共35页质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的环状双链DNA分子。质粒、噬菌体、动植物病毒质粒、噬菌体、动植物病毒基因的运输工具运载体运载体的种类：运载体的种类：基因工程的操作工具基因工程的操作工具第26页/共35页在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有标记基因，以便进行筛选。对受体细胞无害、易分离。载体DNA分子大小应适合，便于提取和操作。运载体的作用：运载体的作用：运载
12、体必须具备的五个条件：运载体必须具备的五个条件：作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制基因工程的操作工具基因工程的操作工具第27页/共35页大肠杆菌的质粒：最最常常用用的的质质粒粒是是大大肠肠杆杆菌菌的的质质粒粒，其其中中常常含含有有抗抗药药基基因因，如如抗抗四四环环素素的的标标记记基基因因。质质粒粒的的存存在在与与否否对对宿宿主主细细胞胞生生存存没没有有决决定定性性作作用用，但但复复制制只只能能在在宿宿主主细胞内完成细胞内完成。基因工程的操作工具基因工程的操作工具第28页
13、/共35页目的基因所在片段目的基因所在片段运载体运载体PStPStDNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA运载体自连运载体自连目的基因目的基因 自连自连CTTAACTTAAG GCTTAACTTAAG GCTTAACTTAACTTAACTTAAG GG GPSt PSt 目的基因与运载体连接目的基因与运载体连接第29页/共35页pBR322质粒结构如果外源如果外源DNADNA插入，氨卞插入，氨卞青霉素抗性青霉素抗性基因失活基因失活标记基因标记基因进行筛选进行筛选限制性内切酶限制性内切酶识别序列识别序列外源基因连接外源基因连接PStPStPStPSt自主复制自主复制第30页/共35页通过长期
14、的进化，细菌中含有某种限制酶的通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识分子中不具备这种限制酶的识别切割序列别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲基转移通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外被切断，并且可以防止外源源DNA的入侵。的入侵。Q3：为什么限制酶不剪切细菌本身的：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？思考与讨论思考与讨论第31页/共35页原核生物易受自然界外
15、源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但生物在长期，但生物在长期的进化过程中形成了一套的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶将外源利用限制酶将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自、使之失效，从而达到保护自身的目的。身的目的。Q4：你能推测限制酶存在于原核生物中的作：你能推测限制酶
16、存在于原核生物中的作用是什么吗？用是什么吗？思考与讨论思考与讨论第32页/共35页不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：Q5：天然的：天然的DNA分子可以直接用做基因工程分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？载体吗？为什么？思考与讨论思考与讨论在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有标记基因，以便进行筛选。对受体细胞无害、易分离。载体DNA分子大小应适合，便于提取和操作。天然的质粒要进行人工改造后才能用于基因工程操作天然的质粒要进行人工改造后才能用于基因工程操作第33页/共35页迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单连接酶都不具有连接单链链DNA的能力。具体原因尚不明确，有待研究。的能力。具体原因尚不明确，有待研究。Q6：DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？思考与讨论思考与讨论第34页/共35页感谢您的观看！第35页/共35页