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1、本章内容第一节氨基酸的结构与分类第二节氨基酸的性质第三节氨基酸混合物的分离第四节蛋白质概论第五节蛋白质的一级结构第六节蛋白质的三维结构第七节蛋白质的理化性质与分离纯化第1页/共110页第一节氨基酸的结构与分类 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位（构件分子）。从各种生物体内发现的氨基酸已有180多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种，这20种氨基酸称为常见氨基酸或基本氨基酸。amino acid,aa 或 AA第2页/共110页一、氨基酸的结构氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式 或或氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的R基不同，（除脯氨酸外）都为L-氨基酸。第3页/共110
2、页H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式R第4页/共110页据R基团化学结构分类 脂肪族A（16种）芳香族A(Phe、Tyr、Trp)杂环(His、Pro)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA不带电荷带电荷带正电荷（种）带负电荷（种）据酸碱性质分类中性（一氨基一羧基）酸性 (一氨基二羧基 )GluGlu、AspAsp碱性()()（二氨基一羧基）LysLys、HisHis、ArgArg据营养学分类 必需非必需人的必需氨基酸Met Trp Lys Val Ile Leu Phe ThrMet Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr假 设 来 借
3、一 两 本 书 ArgArg、His TrpHis Trp、CysCys二、基本氨基酸的分类第5页/共110页甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸 （Val,V）亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸 （Ile,I）1.侧链只是烃链（5种）脂肪族氨基酸第6页/共110页2.侧链含有羟基（2种）丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸 （Thr,T）第7页/共110页3.侧链含硫原子（2种）半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸 （Met,M）第8页/共110页4.侧链含有羧基或酰胺基（4种）天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺 （Gln,Q）第9页/共110页5.侧链
4、含有碱性基团（3种）赖氨酸 （Lys,K）精氨酸（Arg,R）组氨酸 （His,H）第10页/共110页芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸 （Trp,W）第11页/共110页杂环氨基酸组氨酸（His,H）脯氨酸 （Pro,P）第12页/共110页非非极极性性氨氨基基酸酸第13页/共110页极极性性中中性性氨氨基基酸酸第14页/共110页带正电荷的氨基酸带正电荷的氨基酸带负电荷的氨基酸带负电荷的氨基酸第15页/共110页三、不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的基本氨
5、基酸衍生而来的。第16页/共110页非蛋白质氨基酸：存在于生物体内，但不组成蛋白质的呈游离或结合态的氨基酸，约150种，具有多种生理功能。（1）L-氨基酸的衍生物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。（2）D-氨基酸D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短杆菌肽S的组分。（3）、-氨基酸-Ala是泛酸的前体，-氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。第17页/共110页第二节氨基酸的性质一、氨基酸的构型、旋光性和光吸收构型：组成蛋白质的氨基酸除GlyGly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-D-型和L-L-型。第18页/共110页
6、以丙氨酸为例：第19页/共110页 如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为-,-,-，别，别-和别和别-氨基酸。氨基酸。L-苏氨酸苏氨酸(L-threonine)D-苏氨酸苏氨酸(D-threonine)L-别别-苏氨酸苏氨酸(L-allo-threonine)D-别别-苏氨酸苏氨酸(D-allo-threonine)第20页/共110页自然界中组成蛋白质的氨基酸都是自然界中组成蛋白质的氨基酸都是L-L-型。型。(Gly(Gly除外除外)第21页/共110页旋光性：旋光性：组成蛋白质的氨基酸除GlyGly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性
7、，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“”号表示。是AAAA的物理常数，与结构、PHPH值有关。消旋消旋外消旋外消旋内消旋内消旋第22页/共110页第23页/共110页光吸收：组成蛋白质的氨基酸中，TrpTrp、TyrTyr和 PhePhe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm280nm附近。第24页/共110页pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pH中性AA酸性AA逐步提高洗脱液pH和离子强度第54页/共110页习题举例:有一种蛋白质水解物,在pH6时,用阳离子
8、交换柱层析分离,第一个被洗脱的氨基酸是()A.Val(pI5.96)B.Lys(pI9.74)C.Asp(pI2.77)D.Arg(pI10.76)E.Tyr(pI5.66)第55页/共110页二、电泳氨基酸在pH高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过氨基酸在电场中泳动而达到分离各种氨基酸的技术,称为电泳(elctrophoresis)。分离氨基酸混合物常用纸电泳。第56页/共110页第四节蛋白质概论一、蛋白质的定义一、蛋白质的定义 蛋白质蛋白质(Protein，pr)：是一切：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基生物体中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的顺
9、序，通过肽键连接酸按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物而成的一条或多条肽链构成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。传性状的一类主要物质。第57页/共110页二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分蛋白质是生物体重要组成成分 分布广分布广 含量高含量高2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能 1）催化生物化学反应（酶）催化生物化学反应（酶）2）结构成分）结构成分(结缔组织的胶
10、原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白)3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6）激素功能（胰岛素）激素功能（胰岛素）7）防御功能（抗体、血凝蛋白）防御功能（抗体、血凝蛋白）8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）3.氧化供能氧化供能第
11、58页/共110页三、蛋白质的元素组成主要有主要有C、H、O、N 和和 S。有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铜、锌、铁、铜、锌、锰、钴、钼锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16，这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含N量6.25第59页/共110页1.1.按组成分类 单纯蛋白质 这类蛋白质只含有-氨基酸组成，不含其它成分。例如：RNARNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋 白等。结合蛋白 由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，这些非蛋 白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。糖蛋
12、白：如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：如血清-，-脂蛋白等。核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。四、蛋白质的分类第60页/共110页2.2.按蛋白质的外形分类 球状蛋白质外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。纤维状蛋白质分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。第61页/共110页3.3.按多肽链条数分类 单体蛋白质仅含一条多肽链。
13、多聚蛋白质含两条或多条多肽链。例如：牛核糖核酸酶：一条多肽链胰岛素：两条（两种）多肽链血红蛋白：四条（两种）多肽链第62页/共110页胰岛素牛核糖核酸酶血红蛋白第63页/共110页五、蛋白质的分子结构层次一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构蛋白质的一级结构决定高级结构！第64页/共110页第五节蛋白质的一级结构一、肽（peptide）1.肽的结构和命名肽是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的无分支线
14、形聚合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。氨基酸间缩水形成的共价键称肽键(peptidebond)。第65页/共110页+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸第66页/共110页*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽寡肽(oligopeptide)，由更多由更多 的氨基酸相连形成的肽称的氨基酸相连形成的肽称多肽多肽(polypeptide)。*多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而是指许多氨基酸之间以肽键连
15、接而成的一种结构。成的一种结构。第67页/共110页N 末端：多肽链中有自由氨基的一端末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端氨基酸的顺序是N 端C 端的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gly 丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸COOH第68页/共110页.肽键的结构特点：氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为肽平面。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结构存在。第69页/共110页酰胺平面 由肽键周
16、围的6个原子组成的刚性平面 C NH OOCa C N CaH键键键键长长长长介介介介于于于于单单单单双键之间双键之间双键之间双键之间 O C NH+第70页/共110页v虽是单键却有虽是单键却有双键双键性质性质v周边六个原子在周边六个原子在同一平面同一平面上上v前后两个前后两个a a-carbon-carbon在对角在对角(trans)(trans)CNCHaNCOCa0.123nm0.123nm0.132nm0.132nm0.153nm0.153nm0.147nm0.147nmC-N 0.149 nmC-N 0.149 nmC=N 0.127 nmC=N 0.127 nm第71页/共110
17、页相关名词：肽单元：参与肽键的6个原子被约束于一个平面上，与此相应的-C-CO-NH-C-则称为肽单元。多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长链骨架(C-CO-NH-C.)为多肽链的主链。或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链，称为主链。多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团为多肽侧链。或：氨基酸残基的R-基连在主链上成为侧链。说明：各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（R-基）的顺序即氨基酸的顺序各不相同。第72页/共110页.肽的理化性质类似于氨基酸性质）旋光性）两性解离及等电点）化学反应 双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的
18、复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度。第73页/共110页.天然存在的活性肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。第74页/共110页 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)-第75页/共110页GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，作
19、用是保护巯基酶，或防止过氧化物积累。第76页/共110页抗生素类多肽抗生素类多肽短杆菌肽S 第77页/共110页 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽激素类多肽激素类多肽第78页/共110页二、蛋白质一级结构的测定1.1.蛋白质一级结构:蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。一级结构中包含的共价键主要指肽键和二硫键。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNAmRNA中的核苷酸序列决定的。第79页/共110页蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目;(2)多肽链的氨基酸顺序;(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重
20、要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。第80页/共110页2.蛋白质一级结构测定的意义是推测蛋白质高级结构的分子依据是理解蛋白质生理功能的分子基础是阐明遗传疾病发生机理的分子手段是研究生物进化的分子佐证第81页/共110页 胰岛素一级结构高级结构第82页/共110页正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图镰刀形红细胞正常红细胞-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys第83页/共110页不同生物与人的CytcC
21、ytc的AAAA差异数目生物 与人不同的AAAA数目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35粗早链孢霉 43酵母 44 第84页/共110页不同生物来源的细胞色素c c中不变的AAAA残基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGl
22、yThrMetAsnLeu血红素 细胞色素c c分子的空间结构不变的AAAA残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。第85页/共110页3.一级结构测定的原则和基本流程一级结构测定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。第86页/共110页将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定拆开二硫键纯蛋白质蛋白质顺序测定
23、基本战略第87页/共110页通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列第88页/共110页一级结构测定的基本流程:（1）拆分蛋白质分子的多肽链;（2）鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基;（3）用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小的片段;（4）测定各肽段的氨基酸序列;（5）重建完整多肽链的一级结构;（6）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置；（7）酰胺基位置的确定。第89页/共110页测定蛋白质的一级结
24、构前的准备工作A.样品纯度必须样品纯度必须97%以上；以上；聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带B.测定蛋白质的相对分子质量；测定蛋白质的相对分子质量；SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法，凝胶过滤法，沉降系数法C.测定蛋白质多肽链种类和数目；测定蛋白质多肽链种类和数目；种类：种类：SDS-PAGE 数目：数目：N末端氨基酸残基摩尔数末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数蛋白质摩尔数D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数；个数；E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量
25、。第90页/共110页 酸水解：常用6 mol/L6 mol/L的盐酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸在105-105-110110条件下进行水解，反应时间约2020小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。碱水解：一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。酶水解：应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的
26、产物为较小的肽段。第91页/共110页4.蛋白质的一级结构测定1）多肽链的拆分获得单条线形多肽链由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体等。第92页/共110页拆分非共价键：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理。拆分二硫键：几条多肽链通过二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在二硫键交联在一起。可在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存盐酸胍存在下，在下，用过量的用过量的 -巯基乙醇巯基乙醇处理，处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防基化试剂保护生成的巯基
27、，以防止它重新被氧化。止它重新被氧化。拆分第93页/共110页巯基的保护第94页/共110页2）N-末端和C-末端氨基酸残基的确定为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点N端分析方法：二硝基氟苯法（DNPDNP法、DNFBDNFB法或FDNBFDNB法）第95页/共110页 丹磺酰氯法（DNSDNS法）丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质第96页/共110页 苯异硫氰酸(酯)法（PITCPITC法、PTCPTC法、PTHPTH法、EdmanEdman降解法 ）由于其连续反应特性，成为蛋白质序列分析仪的分析原理！第97页/共110页 氨肽酶（aminopeptidase,Apaseaminopeptida
28、se,Apase）法 AlaValGly氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。第98页/共110页C末端分析方法肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离。第99页/共110页羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y。羧肽酶A能水
29、解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。第100页/共110页（3）多肽链部分裂解成较小的片段化大为小，获得短肽段酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等。化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。第101页/共110页胰蛋白酶：R1=R1=赖氨酸LysLys和精氨酸ArgArg侧链（专一性较强，水解速度快）。第102页/共110页或胰凝乳蛋白酶：R1=R1=苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸Trp,Trp,酪氨酸Tyr Tyr 糜蛋白酶第103页/共110页胃蛋白酶：在疏水性氨基酸处部分水解，最适
30、反应pH为23。第104页/共110页（4）测定各短肽段的氨基酸序列方法：蛋白质序列分析仪原理：1.Edman法2.DNS-Edman法3.有色-Edman法第105页/共110页（5 5）重建完整多肽链的一级结构）重建完整多肽链的一级结构-获得多肽链的完整序列获得多肽链的完整序列利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。第106页/共110页对角线电泳步骤：1.碘乙酰胺封闭-SH2.胃蛋白酶酶切蛋白质（pH2）3.第一向电泳（pH6.5）4.过甲酸氧化处理-S-S-键生成-SO3H5.第二向电泳（pH6.5）6.分离出含二硫键的两条短肽7.测序，与拼接出的多肽链比较，确定二硫键的位置。（6 6）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置第107页/共110页 对角线电泳动态图解对角线电泳动态图解 第108页/共110页（7）酰胺基位置的确定AspAsn、GluGln方法：酶解肽链，产生含有单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn。第109页/共110页感谢您的观看！第110页/共110页