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1、一、电泳的概念一、电泳的概念 电泳（electrophoresis）是指在电解质溶液中，带电颗粒在外加电场的作用下，以不同的速度向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电荷或负电荷。利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离、分析或提纯的方法和技术叫电泳技术。第1页/共37页 COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PH4.0时，带净的负电荷。第3页/共37页2、带电颗粒在电场作用下所受的力：(Charged parti
2、cles under the action of electric field force)(Charged particles under the action of electric field force)电场力 F=qE 阻力 Ff=f q 带电颗粒所带的有效电荷；E 电场强度；带电颗粒在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数 第4页/共37页F=FfqE=f 对于一个球形带电颗粒，服从Stoke定律，即：f=6 r r 为带电颗粒的表观液态动力学半径，为介质粘滞系数。当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动:(When electrophoresis balance,electrically
3、charged particles in uniform motion)(When electrophoresis balance,electrically charged particles in uniform motion)=qE 6 r =qE f 带电颗粒在电场中的差速迁移是电泳分离的基础。第5页/共37页3.影响电泳速度的因素：(The influencing factors of electrophoresis(The influencing factors of electrophoresis rate)rate)样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：缓冲液：成分，pH，离
4、子强度支持介质的筛孔大小：支持介质：电渗作用，吸附作用电渗=qE f=qE 6 r 第6页/共37页三三、电电泳泳装装置置Electrophoresis apparatus第7页/共37页电源电源(power supply)(power supply)水平式电泳槽水平式电泳槽(Horizontal electrophoresis tank(Horizontal electrophoresis tank)垂直式电泳槽垂直式电泳槽(Vertical electrophoresis tank)(Vertical electrophoresis tank)第8页/共37页1.1.按支持介质种类不同分为
5、：惰性介质(Inert medium)(Inert medium)：起支持作用，减少对流，介质本身不参与电泳分离 纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、硅胶电泳、氢氧化铝电泳凝胶介质(The gel medium)(The gel medium)：起支持作用，减少对流，介质本身参与电泳分离琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳2.按支持介质形状不同分为:薄层电泳、板电泳、柱电泳 四、电泳的分类(The classification of electrophoresis)(The classification of electrophoresis)第9页/共37页3.按电泳槽方向不同分为：水平电泳
6、、垂直电泳4.按用途不同分为：分析电泳、制备电泳5.按所用电压不同分为：低压电泳（100V500V）、高压电泳（1000V5000V）6.按分离原理不同分为：移动界面电泳（自由界面电泳）、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳 第10页/共37页7.按样品是否经过还原剂处理分为：还原电泳、非还原电泳8.按凝胶介质中是否加入变性剂分为：变性电泳、非变性电泳9.按电泳系统的均一性分为：连续电泳、不连续电泳10.按样品被分离时凝胶介质的pHpH不同分为：酸性电泳（pH=4.3）、碱性电泳（pH=8.8）第11页/共37页琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophorsis of
7、DNA)第12页/共37页一、琼脂糖凝胶电泳的特点一、琼脂糖凝胶电泳的特点(The characteristics of the agarose gel(The characteristics of the agarose gel electrophoresis)electrophoresis)琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D D半乳糖和半乳糖和3,63,6脱脱水水L L半乳糖连接而成的一种线性多糖。将琼脂糖悬浮于缓半乳糖连接而成的一种线性多糖。将琼脂糖悬浮于缓冲液，加热溶解，冷却后即成琼脂糖凝胶。该凝胶具有刚性冲液，加热溶解，冷却后即成琼脂糖凝胶。该
8、凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度的凝胶孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同应。不同DNA的分子量大小及构型不同，所带净电荷的多的分子量大小及构型不同，所带净电荷的多少不同少不同,电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。第13页/共37页分子筛效应（Molecular sieve effect）：分子量或分子大小和形状不同的带电颗粒通过
9、一定孔径的凝胶时，因受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应（Charge effect）：带电颗粒由于所带电荷量不同，而在电泳中表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。第14页/共37页第15页/共37页EB显带（EB banding）电泳后电泳后EBEB染色染色EBEB加入凝加入凝胶中电泳胶中电泳经EB染色后，电泳结果在波长为254 nm的紫外灯下观察。注意 在分子量相当的情况下，DNA的电泳迁移率依次为：超螺旋环状DNA线状DNA缺口环状DNA第16页/共37页 琼脂糖凝胶电泳由于其所分级分离的生物大琼脂糖凝胶电泳由
10、于其所分级分离的生物大分分子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核酸酸（DNADNA和和RNARNA）和蛋白。）和蛋白。三、电泳的应用三、电泳的应用(Application of electrophoresis)(Application of electrophoresis)(Application of electrophoresis)(Application of electrophoresis)第17页/共37页聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophorsis,PAGE)第18页/共37页 聚丙烯酰胺凝胶是
11、由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称简称Acr)Acr)和和交联剂交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(简称简称Bis)Bis)在加速剂在加速剂N N，N N，N N，N N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(简称简称TEMED)TEMED)和催化剂过和催化剂过硫酸铵硫酸铵(简称简称AP)AP)或核黄素或核黄素(V(VB2B2)的作用下聚合交联的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶成三维网状结构的凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径的大小主要决定于丙烯酰胺的浓度孔，凝胶孔径的大小主要决定于丙烯酰胺的浓度。一、聚丙烯酰胺凝胶的特点一、聚丙烯酰胺凝胶的特点
12、(Poly propylene ethylene amines gel characteristics)化学聚合光聚合 第19页/共37页聚丙烯酰胺凝胶具有如下聚丙烯酰胺凝胶具有如下优点优点(the advantages of(the advantages of poly propylene ethylene amines gel)poly propylene ethylene amines gel)：一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好化学惰性好，在范围较大的化学惰性好，在范围较大的pHpH、温度和离子强度等条、温度和离子强度等条件下稳定；几乎无电
13、渗作用件下稳定；几乎无电渗作用由于可以制得高纯度的单体原料由于可以制得高纯度的单体原料，样品分离重复性较，样品分离重复性较好好样品在凝胶中不易扩散，样品分离灵敏度高，可达样品在凝胶中不易扩散，样品分离灵敏度高，可达10106 6g g容易制备出孔径范围很宽的凝胶，以适应不同的需要容易制备出孔径范围很宽的凝胶，以适应不同的需要无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析作定量分析 第20页/共37页凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关(Gel concentration selection and separation materia
14、l molecular weight)(Gel concentration selection and separation material molecular weight)第21页/共37页第22页/共37页第23页/共37页二、电泳的二、电泳的原理原理1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（nativePAGE）生物大分子在生物大分子在聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小分子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率及构型不同，所带净电荷的多少不同。
15、电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋就不同，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性。白质和酶等生物大分子的生物活性。第24页/共37页分子筛效应(Effect of molecular sieve)：分子量或分子大小和形状不同的带电颗粒通过一定孔径的凝胶时，因受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应(Effect of electric charge)：带电颗粒由于所带电荷量不同，而在电泳中表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。第25页/共37页4.染色聚丙烯酰胺
16、凝胶的常用染色方法有两种：考马斯亮蓝染色法：利用蛋白质染料结合的原理，灵敏度高，可以检测低至810 ng的蛋白质。线性范围是20倍。但染料会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析。银染法：银染是利用甲醛将银离子（Ag+）在蛋白质或者核酸上还原成黑色的单质银，来指示条带。银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低至1 ng的蛋白质。线性范围是40倍。但对某些蛋白质染色效果差，且影响其后的蛋白质测序和质谱分析。第26页/共37页聚丙烯凝胶电泳分析蛋白质（考马斯亮蓝染色）聚丙烯凝胶电泳分析蛋白质（考马斯亮蓝染色）第27页/共37页 聚丙烯凝胶电泳分析核苷酸多态性（银染）聚丙烯凝胶电泳分析核苷酸多态性
17、（银染）第28页/共37页 常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于核苷酸多态性常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于核苷酸多态性和蛋白质的分析、分离。和蛋白质的分析、分离。SDS-PAGE则常用于则常用于测定蛋白质的分子量和蛋白质测定蛋白质的分子量和蛋白质的亚基数。目前的亚基数。目前已发现有些蛋白质不能用已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。原蛋白等。四、电泳的应用四、电泳的应用:(Charge of the application)(Charge of the application)第29页/共37页第30页/共37页第31页/共37页第32页/共37页第33页/共37页第34页/共37页第35页/共37页第36页/共37页感谢您的观看！第37页/共37页