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1、蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质紫外吸收：最大吸收峰为280nm两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定胶体性质沉淀反应：盐析、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀变性、复性水解颜色反应第1页/共15页蛋白质变性蛋白质变性L蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。L导致蛋白质变性的物理因素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。L蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包括：（1）溶解度降低。（
2、2）粘度增加。（3）生物活性丧失。（4）更容易被水解。（5）结晶行为发生变化。第2页/共15页蛋白质的水解蛋白质的水解L蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是，酸水解会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或盐酸，使用最广泛的是盐酸；碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，但不会破坏Trp；酶水解效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样，因此，由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。第3页/共15页四种羧肽酶
3、来源和特异性四种羧肽酶来源和特异性第4页/共15页几种蛋白酶特异性的比较几种蛋白酶特异性的比较第5页/共15页反应名称反应试剂颜色用处双缩脲反应硫酸铜，碱性溶液紫红色（540nm）定量测定蛋白质黄色反应硝酸先产生白色沉淀，加热变黄，再加碱呈橙黄色鉴定含有芳香族氨基酸的蛋白质米伦氏反应硝酸、硝酸汞、亚硝酸、亚硝酸汞混和液先是白色沉淀，加热后变成红色鉴定含有Tyr残基的蛋白质乙醛酸反应乙醛酸、浓硫酸紫色环鉴定含有Trp残基的蛋白质坂口反应次氯酸钠、-萘酚、氢氧化钠红色鉴定含有Arg的蛋白质福林反应磷钼酸、磷钨酸蓝色Lowry法鉴定含有Tyr残基的蛋白质醋酸铅反应醋酸铅黑色含有Cys的蛋白质考马斯亮
4、蓝结合反应考马斯亮蓝G-250酸性溶液蓝色Bradford法定量测定蛋白质蛋白质的各种颜色反应蛋白质的各种颜色反应第6页/共15页蛋白质研究方法蛋白质研究方法假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X1.如何得到这种蛋白质?蛋白质的分离、纯化技术2.这种蛋白质的大小？（SDS-PAGE）3.它的pI是多少？（等电聚焦）4.其他细胞或其他生物体内是否存在？（Western印迹）5.其一级结构如何？（序列分析）6.其三维结构又如何？X-射线衍射和核磁共振第7页/共15页蛋白质纯化蛋白质纯化一、准备工作 要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）
5、纯化蛋白质的原料。二、纯化步骤：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定第8页/共15页第9页/共15页等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI第10页/共15页蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳第11页/共15页Western印迹第12页/共15页蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定直接测定法间
6、接测定法。先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。第13页/共15页测定步骤主要试剂和方法备注1详见蛋白质的纯化2极端pH；8mol/L 尿素；6mol/L 盐酸胍；高盐(常用硫酸氨)。如果肽链之间以二硫键相连，可使用步骤3的方法进行拆分。3过甲酸氧化法；巯基类还原剂还原法：巯基乙醇；二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇。第二种方法需要使用烷基化试剂，如碘代乙酸，防止二硫键从新形成。4氨基酸自动分析仪为步骤6和7选择合适的裂解法提供有用的信息。5N-端测定：Sanger试剂法；丹磺酰氯法；PTIC或其衍生物测定法。C-端测定：肼解法；还原法：使用硼氢化纳将C-端氨基酸残基转变成氨基醇，而将它与其它氨基酸区别开来。羧肽酶法（羧肽酶A、B，参考表4-2）如果N-端氨基被封闭，不能直接使用表中的方法，需要根据可能的封闭类型，区别对待。如果氨基是被甲酰或乙酰化封闭的，需要先将甲酰基或乙酰基水解。如果氨基是被焦谷氨酰化封闭的，可以使用专门水解焦谷氨酸残基的焦谷氨酸氨肽酶，直接进行分析。6酶解法；化学裂解法（BrCN）7同上8蛋白质序列自动分析仪；质谱法片段重叠自动分析仪的原理为Edman降解9对角线电泳蛋白质一级结构测定的主要步骤蛋白质一级结构测定的主要步骤第14页/共15页感谢您的观看！第15页/共15页