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1、微生物指标菌落总数总大肠菌群耐热大肠菌群第1页/共21页一、菌落总数1.方法平皿计数法2.定义:菌落总数（standard plate-count bacteria）水样在营养琼脂上有氧条件下37培养48h后，所得1mL水样所含细菌的总数。厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。3.主要培养基：营养琼脂4.主要仪器：培养箱36+1 等第2页/共21页5.检验步骤生活饮用水 1mL水样+15mL45左右琼脂 摇匀，做平行样和空白
2、对照。冷却后，翻转平板，36+1 培养48h后计数。水源水 先制成1：10，1：100等稀释液，再按生活饮用水的检验步骤进行检验。第3页/共21页注意事项（1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。（2）吸液体时液体不能进入吸头。（3）样品稀释时一定要混匀。（4）倒培养基前，瓶口要过火焰。（5）一定要有空白对照。（6）培养基温度控制，培养基薄厚。第4页/共21页6.菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，
3、而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。第5页/共21页7.不同稀释度的选择及报告方法首选30300之间进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例1）。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（见表1实例2），若大于或等于2则报告其中稀释度较小的菌落数（见表1实例3、4）。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以
4、稀释倍数报告之（见表1实例5）。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例6）。第6页/共21页若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例7）。若所以稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。如果所以平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两
5、位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。第7页/共21页表1 稀释度选择及菌落总数报告方式实例实例不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两个稀释度两个稀释度菌落数之比菌落数之比菌落总数菌落总数/（CFU/mL）报告方式报告方式/(CFU/mL)1010-1-11010-2-21010-3-31 113651365164164202016400164001600016000或或1.6104 42 22760276029529546461.61.637750377503800038000或或3.8104 43 32890289027127160
6、602.22.227100271002700027000或或2.7104 44 415015030308 82 21500150015001500或或1.5103 35 5多不可计多不可计16501650513513513000513000510000510000或或5.1105 56 6272711115 5270270270270或或2.7102 27 7多不可计多不可计305305121230500305003100031000或或3.1104 4第8页/共21页二、总大肠菌群1.方法多管发酵法（另有滤膜法和酶底物法）2.定义 总大肠菌群（total coliforms）指一群在37培养
7、24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。3.主要培养基：乳糖蛋白胨培养液、伊红美兰培养基和革兰氏染液。4.主要仪器：培养箱、平皿和试管等。第9页/共21页5.检验步骤乳糖发酵试验 取1mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种
8、1，0.1，0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。接种管置36+1 培养箱内，培养24h+2h后,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。第10页/共21页分离培养 将产酸产气的发酵管分别转钟在伊红美兰琼脂平板上，于36+1 培养箱内培养18h24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰染色、镜检和证实试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红
9、色、中心较深的菌落第11页/共21页证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36+1 培养箱内培养24 h+2h,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。第12页/共21页6.结果报告查表 根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（most probable number,最可能数）检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。5管法结果见表2,15管结果见表3.稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。（表3略）第13页/共21页表2 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MP
10、N）5 5个个10mL管中阳性管数管中阳性管数最可能数（最可能数（MPN）0 02.21 12.22.22 25.15.13 39.29.24 416.016.05 51616第14页/共21页三、耐热大肠菌群1.方法多管发酵法（另有滤膜法）2.定义 耐热大肠菌群（thermotolerant coliform bacteria）用提高培养温度的方法将自然环境汇中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5 仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。3.主要培养基：EC培养基和伊红美兰琼脂4.主要仪器：恒温水浴培养箱第15页/共21页5.检验步骤 自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中
11、取1滴转钟于EC培养基中，置44.5 水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养液面），培养24 h+2h后，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转钟于伊红美兰琼脂平板上，置44.5 培养18h24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。第16页/共21页如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌污染时，可直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群接种乳糖蛋白胨培养液在44.5 +0.5 水浴中培养。第17页/共21页6.结果报告根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每100m
12、L水样中耐热大肠菌群的最可能值。第18页/共21页耐热大肠菌群的卫生学意义作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。通常情况下耐热大肠菌群与总大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为近期水体直接或间接地受到了粪便污染。因而，与总大肠菌群相比，耐热大肠菌群在水体中的检出，说明水体更为不清洁，存在肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。第19页/共21页耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部分将培养温度提高到4445，
13、在此条件下仍能生长和发酵乳糖的菌群被称为耐热大肠菌群。它们由埃希氏菌属以及克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属中的一些菌种组成。这些生物中只有埃希氏大肠杆菌是粪源特异性的，就是指通常大量存在于人类、其它哺乳动物和鸟类粪便中，很少在不是粪便污染主体的土壤和水中发现 耐热大肠菌群在供水系统中再繁殖是不可能的，除非管网中有充足的营养物质(生化需氧量(BOD)超过10mgL)或者不合适的物质接触到处理后的水，水温超过15，以及管网中没有游离余氯。从这些参数的含义可以知道他们的可能联系是，在硝酸盐氮,氨氮,耗氧量较高时，水体污染程度较大，其相应的卫生指标总大肠菌群,耐热大肠菌群也比较高，这主要是针对生活污水而言的，因此这种关系在其他类废水中不一定存在。第20页/共21页感谢您的观看！第21页/共21页